Essa medida pode ajudar a responder a perguntas-chave. No campo da humanologia. Essa resposta na função de macrófagos sob o fim fisiológico de condições patológicas.
A principal vantagem desta técnica é que a polietileneimina revestida pode en vitro eficientemente sem comprometer a célula. Sob doses ideais. As implicações dessa técnica se estendem à terapia e ao diagnóstico de muitos distúrbios inflamatórios crônicos e cânceres.
Onde os macrófagos desempenham um papel essencial na patogênese. Demonstrando o procedimento será Na Jia. Um estudante de pós-graduação do meu laboratório.
E Kaixuan Wang, um estudante de pós-graduação do laboratório do Dr. Xiaohua. Para preparar nanopartículas de óxido de ferro super paramagnética modificadas modificadas ou spion primeiro adicionar 28 gramas de hexahidrato de cloreto de faraó. E 20 gramas faraós autoato heptahydrate a um béquer contendo 80 mililitros de água deionizada.
E use um conduíte de vidro para introduzir nitrogênio na solução. Mexendo até que a matéria sólida tenha dissolvido. Aqueça a mistura de reação a 72 graus Celsius com agitação a 800 rotações por minuto.
E adicione 40 mililitros de 28% de água de amônia ao béquer. Depois de cinco minutos adicione nove mililitros de ácido aliado gota sábia. E mantenha a mistura a 72 graus Celsius por três horas com agitação contínua.
No final da incubação esfrie a solução resultante para a temperatura ambiente. E precipitar a mistura através da separação magnética de acordo com os protocolos padrão. Em seguida, lave o SPION contendo precipitado três vezes com álcool etílico absoluto.
E asperse o precipitado em 100 mililitros de n-hexano. Para preparar o ácido acrílico modificado, o SPION's de ácido acrílico adiciona 800 miligramas do spion modificado do ácido aliado. Dispersados em 200 mililitros de n-hexano e 400 miligramas de ácido acrílico dimercapto dispersados em 200 mililitros de acetona em um frasco de três pescoços em um banho de água a 60 graus Celsius.
Em seguida, adicione 200 microliters de trietilamina gota sábia ao frasco com agitação a 1000 rotações por minuto e refluxo. Um precipitado preto pode ser obtido por separação magnética após cinco horas. Em seguida, use hidróxido de tetrametamônio para ajustar o pH da solução para dispersão homogênea do SPION hidrofílico em água desionizada.
Spion revestido de polietileneimina degenerada adicionam o ácido acrílico modificado solução coloidal do SPION modificada em uma solução de polietileneimina de 10 quilodalton. Em um frasco de três pescoços de 500 mililitros sob agitação mecânica a 1000 rotações por minuto durante duas horas. No final da incubação adicione a solução resultante a um tubo de ultra filtração com um peso molecular cortado de 100 kilodaltons e um conteúdo de 15 mililitros.
Subsutilize a amostra até que a solução restante atinja um volume de um mililitro. Adicione água deionizada à solução para trazer o volume de volta para 15 mililitros. E centrafuse e reidratar a solução mais dez vezes como acabou de demonstrar.
Em seguida, filtre a solução através de um filtro de 22 mícrons para armazenamento a quatro graus Celsius. Para preparar as nanopartículas siRNA primeiro adicione três microlitradores de 20 soluções de siRNA micromolar recém-preparadas para cinco tubos microcentroafusados gratuitos da RNA. E adicione 0, 8, 1,6, 3,2 e 6,4 microgramas de SPION de polietileneimina aos tubos rotulados zero, um, dois, quatro e oito, respectivamente.
Depois de misturar com tubos suaves, incubar as amostras por 30 minutos à temperatura ambiente para permitir que os complexos de siRNA spion de polietileneimina se formem. E prepare um gel de 3% de agarose com a ágarose da pureza. No final da incubação adicione um microliter de 6X buffer de carregamento de DNA por cinco microliters de amostra para cada tubo e misture cuidadosamente.
Em seguida, carregue todas as amostras no gel. E executar eletroforese a cinco volts por centímetro. Até que o corante azul bromofenol migra dois terços do comprimento no gel.
Um dia antes da transfecção lavar um micrófago de camundongos como a cultura celular RAW264.7 com PBS. E trate as células com um mililitro de 25% de trippsina por cinco a dez minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. Quando a maioria das células se separaram.
Inativar a trippsina com cinco mililitros de DMEN completo. Em seguida, pippete a solução várias vezes para dispersar quaisquer aglomerados celulares. Transfira a suspensão celular para um tubo de conackel de 15 mililitros estéril para centrifugação.
Em seguida, suspenda novamente as células em cinco mililitros de DMEN completo fresco para contar. Diluir as células para uma concentração de 4,5 vezes dez para a quarta células por mililitro de concentração completa de DMEN. E adicione dois mililitros de médio a cada poço de uma placa de seis poços para uma incubação de 24 horas na incubadora de cultura celular.
No dia seguinte, prepare a razão apropriada de nanopartículas de siRNA spion de polietileneimina em um tubo de microcentrifuge de fluxo de RNA de 1,5 mililitro com mistura suave como apenas demonstrado. E adicione o volume apropriado de polietileneimina SPION siRNA nanopartícula complexa a cada poço que foi substituído por um mililitro de meio fresco. Prepare os complexos spion si de polietileneimina.
neste caso, muitos mais meses de SPION de polietileneimina podem ser usados assim minimizando sua toxicidade potencial. Em seguida, gire a placa cuidadosamente para obter uma distribuição uniforme das nanopartículas através das partes inferiores do poço. Devolva a placa à incubadora de cultura celular até a atualização celular subsequente ou a análise da deficiência de knockdown genético.
SPION de polietileneimina com potencial zeta de 30,5 e 37 milivolts não apresentam uma toxicidade cito aparente em concentrações de até 30 microgramas de ferro por mililitro. Que é cerca de duas vezes a contratação do que a concentração normalmente usada para transfecção celular. O potencial zeta da POLIetileneimina SPION de 48 milivolts, no entanto, são tóxicos.
Mesmo na dose mais baixa examinada. Como analisado pela citometria de fluxo, mais de 90% das células podem ser transfeinadas com complexos de siRNA de polietileneimina fluorescente a 15 microgramas de ferro por mililitro. A avaliação dos efeitos das concentrações de siRNA de polietileneimina spion na internalização celular esmagando manchas azuis revela uma coloração minimamente detectável a 7,5 microgramas de ferro por mililitro.
Mas manchas claramente visíveis a 15 microgramas de ferro por mililitro que não aumentam em concentrações mais altas de ferro provavelmente devido à absorção de saturação de saturação de absorção de siRNA de polietileneimina SPION. Macrófagos peritoneais transfectados com siRNA específico de polietileneimina SPION apresentam uma diminuição significativa nos níveis de mRNA de targe em comparação com siRNA não específica. Sugerindo que o siRNA pode escapar de vesículas endocíticas para o citoplasma para alcançar as máquinas de interferência de RNA.
Além disso, após a injeção intravenosa de uma única dose de polietileneimina SPION siRNA nanopartículas flocentimétricas análise flocentimétrica de células positivas CD11b e CD3 positivo revela uma absorção mais eficiente das nanopartículas pelo CD11b expressando macrófagos do que por células positivas CD3 a qualquer momento em todos os órgãos examinados. Ao tentar este procedimento é importante lembrar-se de preparar os SPIONs de polietileneimina com um potencial médio de dados não superior a 37 milvolts e preparar os complexos de siRNA SPION de polietileneimina nas relações de ferro baixo para siRNA. Essa técnica compara a necessidade de os pesquisadores explorarem o potencial terapêutico de segmentação do macrófago em motores animais de doenças humanas, como e câncer.
