El error de Rhodopsin causa degeneración progresiva de la retina llamada retinitis pigmentosa. Mientras que un método de imagen tradicional tiene una capacidad limitada para cuantificar el transporte de rodopsinas, este ensayo basado en imágenes recientemente desarrollado permite un cribado de alto rendimiento, eliminando falsos positivos. Esta técnica permite una evaluación rápida de la farmacodinámica farmacológica.
En el ojo de rescatar el plegado de rodopsila causante de la enfermedad, acelerando así el potencial de un tratamiento para la enfermedad silenciosamente intratable y cegadora, la retinitis pigmentosa. La localización celular de una proteína de membrana es muy importante por su función. Este método se puede modificar y aplicar fácilmente para cuantificar el transporte de cualquier otra proteína de membrana de interés.
Asegúrese de preparar un mapa de placas y agregar y aspirar suavemente líquido de cada pozo de la placa, para mantener el número de célula y las condiciones de estado inmunológico consistentes entre las células. Esto producirá un factor Z alto y resultados fiables. Para empezar, sembrar 5000 células por pozo en un negro pared, fondo transparente, poli lisina tratada 384-bien-placa.
Incubar la placa a 37 grados celsius con cinco por ciento de CO2 durante tres horas para que las células se adhieran a la parte inferior de la placa. A continuación, utilice una pipeta multicanal para añadir 10 microlitros por pozo de soluciones de trabajo 5X, de acuerdo con un mapa de placas predeterminado como el que se muestra aquí. Ahora, agregue 10 microlitros por pozo de 2%DMSO a las columnas 22 y 24.
Además, agregue 10 microlitros por pozo de 25 micromolares 9-cis-retinal a la columna 23 en una habitación oscura bajo la luz roja tenue. Cuando termine de cargar todos los diversos compuestos de prueba, cubra la placa con papel de aluminio e incubar a 37 grados Celsius durante 24 horas. Saca la placa de 384 pozos en una habitación oscura con luz roja tenue.
Aquí, utilizando el aspirador de 8 canales, conectado a una botella de recogida al vacío, para aspirar suavemente el medio de los pozos de la placa. A continuación, utilice una pipeta multicanal para agregar 20 microlitros por pozo de 4%Paraformaldehído recién preparado a toda la placa de 384 pozos, y fije las celdas durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación, coloque la placa en la luz normal.
Allí, utilice un aspirador de 8 canales, para aspirar el Paraformaldehído en cada pozo, y utilice una pipeta multicanal para agregar 50 microlitros por pozo de PBS. Aspirar y reemplazar el PBS para un total de tres ciclos de lavado. Luego, agregue 20 microlitros por pozo de 5% de suero de cabra a cada pozo, e incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Después de la incubación, aspirar los pozos, y añadir 15 microlitros de 20 microgramos por mililitro B630 anticuerpo anti-rhodopsin, en 1%suero de cabra a los pozos en las filas A a O.Next, añadir 15 microlitros por pozo de 1%suero de cabra a la fila P para el anticuerpo secundario sólo grupo de control. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 90 minutos, o a cuatro grados centígrados durante la noche. A continuación, cubra la placa con papel de aluminio para evitar el fotoblanda de los fluoróforos.
A continuación, lave la placa tres veces con 50 microlitros por pozo de PBS. Después del último lavado, aspirar el PBS, y añadir 15 microlitros por pozo de cinco microgramos por mililitro de anticuerpos IgG anti-ratón de cabra conjugados Cy3. Cubra la placa con papel de aluminio e incubar las muestras a temperatura ambiente durante una hora.
Después de la incubación, lave el plato tres veces. A continuación, agregue 50 microlitros por pozo de PBS, que contienen un microgramo por mililitro de tinción de Hoechst a temperatura ambiente durante 15 minutos. Por último, selle la placa del pozo con una película transparente, cúbrala con papel de aluminio y guárdela a cuatro grados centígrados durante una semana.
Retire la lámina y coloque la placa de muestra en un imager de alto contenido, con A1 colocado en la esquina superior izquierda de la placa. A continuación, abra el software de adquisición de imágenes para configurar los parámetros para la adquisición de imágenes. Abra la ventana de configuración de adquisición de placas y cree una nueva configuración o cargue un archivo de configuración existente.
Seleccione el objetivo 20X y configure el binning de píxeles como dos, de modo que el tamaño de píxel calibrado sea de 0,80 por 0,80 micras. A continuación, establezca las líneas de escaneado como 2000 y el tamaño de la imagen como 1000 por 1000 píxeles por sitio. A continuación, seleccione el tipo de placa que desea establecer la imagen.
Utilice la información proporcionada por el fabricante para rellenar las dimensiones de la placa. Ahora, seleccione los pozos que se van a crear imágenes junto con cuatro sitios para ser imageados por pozo. Evite el lado del pozo, que son tocados por las puntas de aspiración.
Para imágenes, seleccione láseres de excitación como 405, 488 y 461 nanómetros. A continuación, seleccione los filtros de emisión para los canales DAPI, FITC y Texas Red. Optimice la potencia láser y las ganancias de cada canal, para garantizar que los pozos de control positivos no estén saturados.
Seleccione bien para enfocar bien para el enfoque automático. A continuación, seleccione el pozo inicial que se va a adquirir y establezca el foco automático del sitio para todos los sitios. Además, seleccione cuatro promedios por línea para cada canal y optimice el valor de desplazamiento Z para cada canal.
Validar, que todo está correctamente configurado, probando primero de dos a tres pozos en las esquinas de la placa, para asegurarse de que las imágenes están en el foco para todos los pozos probados. A continuación, compruebe que las imágenes de todos los sitios por pozo tienen celdas con más del 40% de confluencia. Por último, compruebe, que las intensidades de fluorescencia en todos los canales están casi la mitad saturadas en los pozos de control 100%.
A continuación, guarde el método de adquisición de imágenes y ejecute toda la placa. Observe el imager hasta que termine de capturar imágenes de la primera columna de la placa para comprobar la calidad de la imagen antes de salir del imager. Cuando haya terminado, retire la placa y guárdela a cuatro grados Centígrados para su uso futuro.
Extraiga los datos de imagen utilizando un software de análisis de imágenes de alto contenido. Seleccione uno de los pozos de control 100% en la columna 23 para configurar los parámetros. En primer lugar, seleccione la puntuación de celda de longitud de onda múltiple como método de análisis y comience a configurar los ajustes adicionales.
Defina los núcleos utilizando imágenes del canal DAPI. Vista previa, para asegurarse de que las formas de núcleos definidos en el pozo seleccionado encajan bien con las imágenes de núcleos. A continuación, defina la forma de la celda en el canal FITC, donde se crea la imagen de Rhodopsin Venus.
Para lograr esto, configure diámetros mínimos y máximos de cada celda, intensidad mínima de fluorescencia sobre el fondo, así como el área mínima de cada celda. Ahora, defina las áreas de manchas de la superficie celular de rodopsina en el canal Rojo de Texas, estableciendo los diámetros mínimo y máximo de la forma celular, la intensidad de fluorescencia de minium sobre el fondo, así como el área mínima de cada célula manchada. Pruebe el algoritmo actual en cinco pozos para determinar si la configuración está optimizada.
A continuación, guarde los ajustes y cierre la ventana de configuración. Ejecute todos los pozos con el método de análisis optimizado. Cuando haya terminado, exporte el número de objeto como el número de celda intacto.
Exporte la intensidad media del canal FITC como la intensidad de Rhodopsin Venus, y exporte la intensidad promedio del Canal Rojo de Texas como intensidad Rhodopsin en la superficie celular. Utilice el software de hoja de cálculo para generar un mapa de calor de dos colores para cada parámetro. Organice el nombre de las líneas de celda en el eje X y los compuestos en el eje Y.
Aquí, nuestras imágenes de P23H rhodopsin Venus trataron células U2OS, expresando fluorescencia de Venus en verde, y inmuno-manchado de la superficie celular en rojo. Las células fueron tratadas con DMSO o cinco micromolares 9-cis-retinal. El ensayo de transporte de rodopsila, comparando la cantidad de rodopsin en toda la célula bajo diversas condiciones, muestra una recuperación significativa en la línea celular mutante P23H, cuando se trata con 9-cis-retinal.
Además, la intensidad de rodopsin en la superficie celular, y la proporción de la mancha de rodopsila en la superficie celular a la intensidad de la venus rodopina en toda la célula, no son significativamente más bajas para el mutante P23H, en comparación con el tipo salvaje de rodopsino tratado con DMSO. Un mapa de calor es una manera eficiente de comparar la cantidad media de rodopsila y la localización por celda entre varios mutantes. Aquí, los controles de tipo salvaje y seis mutantes de rodopsila se enumeran horizontalmente, y los efectos de los tratamientos compuestos se comparan verticalmente.
De acuerdo con estudios anteriores, la intensidad de la rodopsin en la superficie celular y la proporción de la mancha de rodopsila en la superficie celular a la intensidad de La venus rodopsin son menores para los seis mutantes en comparación con el tipo salvaje tratado con DMSO. Los compuestos uno, dos, seis y nueve aumentaron significativamente la proporción de manchas de rodopsina en la superficie celular a la intensidad de la venus rodopsina en mutantes de rodopsina T4R, P23H, D190N y P267L, lo que sugiere que estos compuestos rescatan el transporte de estos mutantes de rodopsin a la membrana plasmática. Tenga en cuenta que las celdas deben estar entre 50 y 70%confluentes antes de la fijación, ya que esto es fundamental para el análisis de imágenes.
Además, mostramos imágenes de pozos en todo el plato. Asegúrese de que las imágenes enfocadas, y que la fluorescencia, que no salen, tienen todo el valor de umbral para cualquier canal. Hasta un compuesto de selección, que el rescate mal plegado rhodopsin transporte, podemos validar el proceso, a continuación, pasar la eficacia de estos compuestos in vivo, utilizando un modelo de ratón que expresa el mutante rhodopsin P23H.
Este método nos permite cuantificar la cantidad de proteína de membrana y su localización. Por lo tanto, es una gran herramienta para micro mistake iniciado en proteína de membrana por ayuda, salvo y degradación. Paraformaldehído, como en este experimento, tiene procedimientos que implican el manejo de este reactivo.
Se hará bajo el capó. Los residuos que incluyan este reactivo deben eliminarse adecuadamente como un producto químico peligroso.
