This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience T&#252;bingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) (BCCN T&#252;bingen, FKZ 01GQ1002 to T.E and T.B.), and the European Union (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 to M.K. and F.P.D).

Todos los animales procedimientos se llevaron a cabo la adhesión a las directrices y leyes para la protección de los animales que determine el Gobierno Federal alemán y aprobados por el comité de bienestar de los animales institucional de la Universidad de Tübingen. 1. Modelos Animales <ol><li> HR2.1: TN-XL Ca 2+ biosensor ratón <ol><li> Utilice la HR2.1 transgénico: línea de ratones TN-XL expresar el Ca 2+ biosensor TN-XL selectivamente en los conos 10. Utilice 3-6 semanas de edad ratones de ambos sexos planteado con un estándar de 12 horas día / noche ritmo. </li></ol></li></ol> 2. Disección de retina <ol><li> Solución fisiológica <ol><li> Preparar recién 2 L de solución extracelular, que contiene NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, 1 mM MgCl2, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 26 mM de NaHCO3, 0,5 mM L-glutamina, y 20 mM (+) glucosa. Mezclar hasta que todos los ingredientes se disuelven. </li><li> Solución extracelular &quot;burbuja&quot;con carboxygen (95% O 2, 5% de CO 2) 5 - 10 min. Añadir CaCl 2 para alcanzar una concentración de 2 mM. </li><li> Después de burbujear la solución extracelular, medir su pH. El pH debe ser 7,4, de lo contrario es probable que se han cometido errores durante la preparación de la solución. Mantenga burbujeante tasa y solución a temperatura constante durante todo el experimento para garantizar un pH constante. </li><li> Separar el caldo en 2 frascos, uno para la disección de retina y una para la configuración de la grabación (perfusión). </li></ol></li><li> Enucleación del ojo y el aislamiento de la retina (5-10 min) <ol><li> Mantener una iluminación roja tenue en el área de trabajo de enucleación. Utilice LEDs con una longitud de onda máxima de 650 nm (o más) para evitar la decoloración de los conos durante la disección. </li><li> Dark-adaptar el ratón durante 2 horas al poner la jaula en una caja a prueba de luz y bien ventilado para asegurar que los conos estén plenamente sensibilizados en el momento de las grabaciones. </li><li> Anestesiar el ratón bajo un Laboratocampana ry con isoflurano (5%) usando un vaporizador y un recipiente hermético a los gases que contiene una jaula de ratón estándar. Siga cuidadosamente las instrucciones del fabricante al manipular el vaporizador. Use guantes y mascarilla para reducir la exposición a los alérgenos. </li><li> Utilice un microscopio binocular con un 10 - magnificación de 40X para la disección. </li><li> Sacrificar el ratón anestesiado por decapitación. </li><li> Para orientación, marque la parte superior de cada ojo (= dorsal) con un lápiz resistente al agua. Lleve un registro de si el uso del ojo izquierdo o derecho. </li><li> Retire el ojo cuidadosamente usando tijeras curvas cortando el nervio óptico detrás del globo ocular. Para la disección, transferir el globo ocular de una placa de Petri que contiene la solución extracelular recién carboxygenated. Para transferir el globo ocular, sujételo por el tronco del nervio óptico. </li><li> Perforar el ojo en cualquier punto a lo largo de la frontera entre la córnea y la esclerótica (es decir, en la ora serrata) con una aguja de inyección agudo. </li><li> Sostenga el correoye en la esclerótica con un par de pinzas y suavemente inserte uno tijeras cuchilla en el agujero hecho en el paso anterior. Corte a lo largo de la ora serrata para separar la parte anterior del ojo (córnea, cristalino, el cuerpo vítreo) de la parte posterior (ocular). Cortar la ojera radial (hacia el disco óptico) en la posición de la marca de la pluma para indicar la posición dorsal en la retina. Nota: Preparado de esta forma, las ojeras se pueden mantener en solución constantemente carboxygenated para su uso posterior. </li><li> Gire el ocular en la placa de Petri tal que el dorsal cortada puntos de distancia de uno mismo. Coge la esclerótica en el lado derecho de la ojera con un par de pinzas izquierda y cada uno mediante la inserción de las puntas de las pinzas entre la retina y la esclerótica. </li><li> Separe la retina invirtiendo suavemente la parte escleral del ocular. Finalmente, cortar el nervio óptico utilizando micro tijeras de disección para liberar la retina de la esclerótica. Nota: Este es un paso crítico. Evitar daños en la retina (por ejemplo, portocar y apretándolo con pinzas). </li><li> Mantenga uno de los bordes de la retina con un par de pinzas y suavemente eliminar los desechos y el cuerpo vítreo de la superficie de la retina utilizando un segundo par de pinzas. Cuando la superficie de la retina está limpio, utilice micro disección tijeras para hacer tres, cortes radiales cortos adicionales (aproximadamente cada 90 °). Estos cortes permiten que uno para aplanar cuidadosamente la retina con la cara hacia abajo de los fotorreceptores en la placa de Petri (Figura 1A). </li></ol></li><li> Preparación rebanada (10 - 15 min) <ol><li> Preparar membranas filtrantes de nitrocelulosa de antemano para la retina rebanar y vidrio cubres de rebanadas de montaje y su transferencia a la cámara de grabación. Cortar la membrana de filtro de nitrocelulosa en aproximadamente 10 x 5 mm piezas rectangulares de tamaño utilizando tijeras. Cortar en trozos rectangulares cubreobjetos aproximadamente 10 x 5 mm de tamaño usando un glasscutter. </li><li> Lentamente sumerja un portaobjetos de vidrio en la solución extracelular cercatejido. Con cuidado, tire de la retina en el portaobjetos de vidrio con el lado de las células ganglionares por el acaparamiento de que en el mismo borde usando un par de pinzas. Este proceso reduce el daño mecánico y plegado de tejido. </li><li> Elija la región de la retina que se relaciona con la respectiva pregunta de investigación (véase también Discusión). Recuerde, el largo corte hecho en el paso 2.2.9 marca el medio de la retina dorsal (Figura 1A). Cortar un rectangular, aproximadamente 1 x 2 mm de tamaño pedazo fuera de la región de la retina seleccionada utilizando una hoja de bisturí curvo. Limpie el exceso de solución alrededor del tejido. </li><li> Coloque la membrana de filtro en la parte superior de la pieza de retina tal que el lado de las células ganglionares se adhiere a la membrana. Inmediatamente, añadir una gota de medio extracelular sobre la membrana para sujetar firmemente el tejido a la membrana. </li><li> Transferir el tejido de la retina membrana montado a la cámara de corte que contiene la solución extracelular fresco. </li><li> Cortar en rodajas retina verticales de 200 micrasespesor (Figura 1B) usando una cuchilla de afeitar fresco unido a un cortador de tejidos 23. Cambie la hoja para cada pieza de la retina. Nota: La hoja de afeitar necesita ser perfectamente alineada con la superficie del fondo de la cámara de corte de tal manera que toda la membrana se divide simultáneamente, como se indica por un &quot;clic&quot; cuando corte - de lo contrario la cuchilla puede doblar y dañar la rebanada. </li><li> Pegue una sola rebanada de membrana montado a un cubre de vidrio mediante la aplicación de grasa de alto vacío a la membrana termina solamente (Figura 1C). Mantenga la superficie del vidrio por debajo de la retina sin grasa. </li><li> Mantenga rebanadas cubreobjetos montados en cubiertas por una gota de solución extracelular en la cámara de retención - un recipiente cerrado y a prueba de luz, por ejemplo, una placa de Petri con la tapa cubierta con papel de aluminio - bajo una atmósfera de carboxygen a TA. Introducir carboxygen burbujeando un pequeño depósito de agua para mantener la atmósfera en la celebracióncámara húmeda; esto evita que las rodajas se sequen. </li><li> Permitir rebanadas para descansar en la cámara de retención durante 10 - 15 min antes de ellos (uno por uno) que se mueve a la cámara de grabación. Las rebanadas se pueden mantener hasta 4-5 horas en la celebración de la cámara a temperatura ambiente (~ 21 ° C). </li></ol></li></ol> 3. De dos fotones Ca 2+ Imaging <ol><li> Microscopía de dos fotones <ol><li> Utilice un microscopio Objetivo Movable (MOM) de tipo microscopio de dos fotones. Ambas diseño e imagen procedimientos MAMÁ se describieron anteriormente 24, para más detalles véase también 10,21,25 (para fuentes y empresas, véase el cuadro 1). Nota: Cualquier vertical microscopio de dos fotones que cumple los siguientes requisitos mínimos pueden ser utilizados: Tiene que estar equipado con (a) un láser de impulsos sintonizable a ~ 860 nm, (b) un mínimo de dos canales de fluorescencia adquiridas simultáneamente, (c ) Filtros para ECFP y fluorescencia citrino, (d)un estimulador de la luz (para posibles diseños, consulte 24,26), y (e) de software que permite la grabación de secuencias de imágenes en el tiempo transcurrido a una velocidad suficiente para resolver el Ca 2 + señales de interés. </li><li> Iniciar el sistema de imágenes de dos fotones según lo indicado por el fabricante. Se deben seguir estrictamente las pautas de seguridad de láser de la instalación. Inicie el láser y ajustarlo a ~ 860 nm. </li><li> Transferir una porción de la cámara de retención de la cámara de grabación y comenzar de inmediato la perfusión con solución extracelular carboxygenated. Mantener una velocidad de flujo de perfusión de 2 ml / min y una temperatura de 37 ° C en la cámara de grabación. </li><li> Use un NA objetivo de inmersión en agua 20X 0.95. Si está disponible, utilice una cámara CCD en combinación con un LED debajo cámara de grabación de infrarrojos para localizar el trozo de la retina (Figura 2). De lo contrario localizar rebanada utilizando imágenes de dos fotones (ver 3.1.5). </li><li> Cambie a la imagen de dos fotones para ver la expresión de biosensor. Encenderlos dos canales de detección de imágenes de fluorescencia de ECFP y citrino. </li><li> Utilice el software de adquisición de imágenes que controla el microscopio de dos fotones para escanear y seleccionar una fila de terminales de cono para la grabación (Figura 3A). Adquisición de imágenes Set de 128 x 16 píxeles (imágenes 31,25 Hz) o una configuración similar. Restringir el área de escaneado a los terminales de cono para evitar el blanqueo de fotopigmentos en segmentos externos. Nota: Para el TN-XL sensor de calcio (τ = ~ 0,6 seg para el Ca 2 + vinculante, τ = ~ 0,2 seg para Ca 2+ unbinding, véase 16) una velocidad de fotogramas mínima de ~ 8 Hz se recomienda. </li></ol></li><li> Estimulación de luz y grabación <ol><li> Utilice una subetapa de campo completo estimulador luz como se describe en otro lugar 10,21,26 para realizar los siguientes pasos. Nota: Una solución sencilla para un estimulador luz de campo completo es utilizar dos LEDs filtrada paso-banda (por ejemplo, &quot;azul&quot;: 360 BP 12, &quot;verde&quot;: 578 BP 10)que coincide con la sensibilidad de longitud de onda de los conos de ratones, pero al mismo tiempo no se solapan con los filtros utilizados para la detección de fluorescencia (cf. 3.2.4). La luz de los LED es enfocada por el condensador a través de la parte inferior de la cámara de grabación (Figura 2). Para más detalles sobre este diseño estimulador, su calibración, las intensidades de luz utilizadas y los conos de fotos tarifas isomerización evocados, ver 10,21,26. </li><li> Encienda el láser y permiten conos para adaptarse al láser de barrido y la luz de fondo de estímulo (20 - 30 seg, consulta peligros potenciales), antes de la presentación de los estímulos de luz (ver 3.2.3) o la aplicación de agentes farmacológicos. </li><li> Iniciar presentación de estímulos arbitrarios (por ejemplo, destellos de luz, como se muestra en la Figura 3B, C). En el caso del estimulador descrito en el paso 3.2.1, generar los estímulos mediante la modulación de la intensidad de los dos LEDs en el tiempo utilizando una placa de microprocesador controlado por software personalizado (paradetalles, ver 10,21,26). </li><li> Comience a grabar los dos canales de fluorescencia (por ejemplo, en 483 nm para &quot;azul&quot; FRET donantes ECFP y a 535 nm para &quot;amarillo&quot; FRET-aceptor;. Para las especificaciones ver Tabla 1) al mismo tiempo usando el software de adquisición de imágenes respectiva (véase también 3.1 0.6). Por ejemplo, en el caso de la luz parpadea (Figura 3 B, C), ficha al menos 8 - 10 presentaciones de estímulo (ensayos). </li></ol></li><li> Calibración &quot;En-slice&quot; Ca 2+ <ol><li> Grabar Ca 2 + señales en terminales de cono (como se describe en 3.1.6 y 3.2.4) y el extracto de la línea de base nivel del Ca2 + en un conjunto de conos (como se describe en 3.4). </li><li> Cambie a &quot;Ca 2+ libre&quot; medio extracelular con 5 ionomycin M (disuelto en DMSO) y 10 mM EGTA (o, alternativamente, BAPTA) agregó. Terminales de cono Record de nuevo cada 5 min para determinar la relación de fluorescencia mínima (R min), &lt;em&gt; es decir, la relación en el (casi) ausencia de Ca2 + intracelular. Esto puede tomar entre 15 - 30 min. Nota: Se requiere un sistema de perfusión que permite cambiar entre los diferentes reservorios. </li><li> Cambiar al medio extracelular con 5 ionomycin M (disuelto en DMSO) y 2,5 mM Ca 2+. Después de un tiempo de incubación de 5 min, conos grabar de nuevo cada 5 min para medir la relación de fluorescencia máxima (R max), es decir, la relación en presencia de concentraciones de saturación de Ca2 + intracelular. Después de la aplicación ionomycin, puede tardar entre 3 - 15 min para la relación de Ca 2+ a estabilizarse. Nota: La exposición de las rodajas a alta Ca 2+ y ionomicina durante un período más largo eventualmente dañar las células. Incluir sólo las células en el análisis que conservan su morfología normal. Las concentraciones (es decir, EGTA, ionomicina) pueden necesitar ser adaptados. Para más detalles sobre la calibración de Ca2 +protocolo, consulte 13,17. </li></ol></li><li> Análisis de los datos Nota: Utilice un paquete de software de procesamiento de imágenes y análisis de datos compatible con el software de microscopio respectiva y capaz de ejecutar secuencias de comandos de análisis personalizados. <ol><li> Carga de un archivo de datos de imagen y dibujar regiones de interés (ROI) alrededor de cada terminal de cono (Figura 3A). Para cada trama, la intensidad media de fluorescencia dentro de la ROI y restar la fluorescencia de fondo, antes de calcular la relación (R) entre FRET-aceptor (citrino) y donante (ECFP) de fluorescencia (R = F A / F D; Figura 3B, C). Esta relación se suele utilizar como sustituto de la relativa concentración intracelular de Ca2 +, pero después de la calibración (véase 3.3), también concentraciones absolutas puede estimarse (ver 3.4.3). Nota: Los pedículos pueden ser reconocidos por su ubicación en la capa plexiforme externa y su morfología (algo aplanada &quot;manchas&quot; más pequeño que el conosomata, situado en el extremo del axón cono). </li><li> Ensayos de estímulo Promedio (Figura 4a). Extraer parámetros de respuesta de los rastros promediados (Figura 4B), tales como 2 + nivel básico Ca (base R) antes de la estimulación de luz, amplitud máxima (R amp), y el área bajo la curva (R A) como medidas para el tamaño de la respuesta. Además, extraer cinética de la respuesta de las trazas promediados, tales como aumento de respuesta (t subida) y tiempo de decaimiento (t decaimiento) (= respectivos intervalos de tiempo entre 20% y 80% de R amp; véase la ilustración en la Figura 4B). Para más detalles sobre cómo determinar estos parámetros, consulte 10. </li><li> Calcular una estimación de la concentración de Ca2 + cono absoluta basada en las mediciones de los pasos 3.3.1-3.3.3. Utilice las proporciones de mínima y máxima concentración de Ca2 +, R y R max min, respectivamente, la fluorescencia de los donantes en el Ca 2+ </sarriba&gt; -bound (F D, ligado-Ca) y -unbound (F D, Ca-libre) del estado, así como la vivo en constante de disociación (K d = 0,77, ver 16) para TN-XL con el siguiente la ecuación (análogo a 27): </li></ol></li></ol><img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/52588/52588eq1.jpg" />

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+interactions+in+the+outer+retina.">Lateral interactions in the outer retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).</li><li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).</li><li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa:+rapid+neurodegeneration+is+governed+by+slow+cell+death+mechanisms.">Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 4, e488 (2013).</li><li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1+gene+knock-out+increases+resistance+to+retinal+degeneration+without+affecting+retinal+function.">PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function.</a> PloS One. 5, e15495 (2010).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Protocolos preexistentes utilizando grabaciones unicelulares electrofisiológicos o Ca 2 + de imágenes con indicadores fluorescentes sintéticos luchan para grabar los Ca 2+ dinámica en los conos de ratones por un número de razones técnicas (véase la Introducción). El protocolo descrito aquí permite la medición de Ca 2 + señales e incluso absolutos niveles de Ca2 + en las terminales individuales, identificadas cono ratón en una forma eficiente y relativamente simple. Este protocolo ya ha sido utilizado con éxito en tres estudios abordar diferentes aspectos de la función de cono en la retina del ratón sano. En el primer estudio 10, el HR2.1: ratón TN-XL se caracterizó mediante inmunohistoquímica, grabaciones ERG, de dos fotones de Ca 2 + de imágenes, y la farmacología, demostrando que la expresión de cono específica del Ca 2+ biosensor no entorpezca la anatomía y función de cono. En el segundo estudio 21, cromáticoy propiedades de respuesta acromáticos de conos de ratones fueron asignadas a través de la retina, lo que demuestra las diferencias notables en función del cono entre el dorsal &quot;verde&quot; opsina dominada y el &quot;azul&quot; retina del ratón ventral opsina dominada. Estas diferencias regionales en las propiedades de cono acertaron la distribución diferencial de contraste en el medio ambiente natural (es decir, cielo vs. suelo), lo que sugiere que los diferentes tipos espectrales de los conos de ratón proporcionan para (cerca) de muestreo óptimo de contrastes acromáticos y, por tanto, puede ofrecer una ventaja evolutiva. En el tercer estudio 22 la retroalimentación recíproca que terminales de los axones cono reciben de células horizontales se investigó. Como todos los mecanismos de retroalimentación celular horizontal propuestas actúan sobre canales de Ca2 + dependientes de voltaje en los terminales de los axones de cono 28, terminal de cono de Ca2 + puede servir como sustituto de la horizontal interacciones célula a cono. El estudio de Kemmler y compañeros de trabajo 22 soportesla opinión de que las células horizontales utilizan un sistema de retroalimentación complejo que comprende varios mecanismos para controlar la liberación de glutamato fotorreceptor. Estos estudios ilustran la versatilidad del protocolo descrito y muestran que se puede adaptar a una amplia gama de cuestiones relativas a la función de cono y sus circuitos sinápticos. Además, el protocolo permite el estudio de la señalización local de Ca 2+ en los diferentes compartimentos de cono, hacia una mejor comprensión de la fisiología de cono. Tal conocimiento es importante entender los procesos fisiopatológicos en los conos en degeneración, para permitir finalmente para el desarrollo racional de los enfoques terapéuticos potenciales, en particular para las enfermedades degenerativas que afectan a los conos. En el HR2.1: línea de ratón TN-XL, el Ca 2+ biosensor se expresa en todo el cono, con la excepción del segmento exterior. Esto proporciona una oportunidad para la evaluación directa y radiométrica de Ca 2+ dinámicas en diferentes compartimentos de cono. Dado que los cambios en Ca 2+ corrientes en el segmento exterior se reflejan en los terminales a través del potencial de membrana y la activación resultante de canales de Ca2 + dependientes de voltaje, los procesos en el segmento exterior se pueden observar indirectamente. Peligros potenciales: La disección de la retina es un paso crítico: En el ratón, la retina se separa de la ojera por lo general entre los segmentos externos de los fotorreceptores y el epitelio pigmentario. Por lo tanto, los segmentos externos de los fotorreceptores sensible a la luz de la retina aislada se exponen y extremadamente sensibles a los daños mecánicos. Gran cuidado se debe tomar para no dañar al tocar el lado de los fotorreceptores con herramientas o moviendo el tejido de lado sobre una superficie adhesiva (por ejemplo, una membrana de filtro). Rebanadas de retina de alta calidad pueden ser reconocidos bajo el microscopio por su superficie de corte limpio ypor una capa de fotorreceptores bien organizado con segmentos externos claramente definidos. Valoración funcional de la calidad rebanada se puede hacer rápidamente mediante el parpadeo luminoso estímulos luminosos y determinar el porcentaje de conos sensibles (por ejemplo, en un campo de visión con 10-20 conos). Aquí, la calidad de respuesta debe ser evaluada mediante el cálculo de la relación señal-ruido (S / N) (amplitud del ruido de la línea de base antes de que el estímulo de luz frente a la amplitud de la respuesta de la luz); un S / N 2 - 3, debería considerarse como el umbral mínimo. Típicamente, descartamos rebanadas con menos de 50% conos sensibles. También rebanadas con conos que muestran el comportamiento clavar espontánea excesiva (vea la Figura 4 en 10) debe ser descartado. Rebanadas de la cámara de registro que cumplan los criterios anatómicos y funcionales antes mencionados muestran respuestas consistentes para 1 - 2 horas (para más detalles sobre la consistencia de respuesta, consulte 10). Debido a que las rebanadas sobreviven por hnuestra en la cámara de contención, un experimento exitoso puede durar hasta 6 horas. Es de destacar que hay algunas restricciones con respecto a estudiar a largo van interacciones espaciales entre conos y células horizontales, como rebanar rompe inevitablemente conexiones laterales en las redes de la retina. Sin embargo, aumentar el espesor de las rebanadas de la retina a 300 micras aminora esta cuestión 22. El uso de las rebanadas de la retina verticales evita la exploración de los segmentos externos de cono sensible a la luz por el láser de excitación y, por lo tanto, impide en gran medida de blanqueo opsina (para una extensa discusión, ver 10,21). Sin embargo, los grabados de Ca 2 + señales no sólo dependen de los estímulos de luz, sino que también se vea afectado por un componente de iluminación de fondo generado por el láser de excitación de exploración. De hecho, la efectiva iluminación de fondo en este tipo de experimentos de imagen de dos fotones es una combinación de luz láser dispersa, luz fluorescente emitida por la oficina registradalls, y cualquier componente del fondo de estímulo LED. Por lo tanto, los conos se debe permitir que adaptarse durante al menos 20 - 30 s a de escaneo láser (con el componente de fondo del estímulo luminoso activado) antes de la grabación. Ventajas y aplicaciones: Mientras que algunas aplicaciones para este cono Ca 2+ protocolo -Imagenología se han descrito anteriormente 10,21,22, otras aplicaciones pueden preverse: Los estudios farmacológicos en combinación con el cono Ca 2 + de imágenes puede validar Ca 2+ vías de señalización en los conos y podrían ser utilizado para probar la eficacia y la potencia de las drogas dirigidas a los diferentes actores en el Ca 2+ para señalización 10. Sin embargo, una aplicación de clave puede ser para estudiar las enfermedades que afectan la función de cono. Muchos modelos de la degeneración de la retina de ratones que imitan enfermedades humanas están disponibles. Por ejemplo, la pérdida de fotorreceptores del cono 1 (CPFL 1) ratón es un cono principal modelo de degeneración sufrimientode una mutación Pde6c 29. Por el contrario, la degeneración de la barra 1 (rd 1) ratón sufre una mutación PDE6B. Si bien esto hace que la barra principal de fotorreceptores degeneración 30, una vez que se completa rd 1 derrota varilla, juegos de degeneración de cono secundaria en 1. Cruzamiento estos animales con el HR2.1: Línea TN-XL permitirá que el estudio y la comparación de Ca2 + dinámica tanto en la degeneración cono de primaria y secundaria y es probable que proporcione información valiosa sobre el papel de Ca 2+ durante la muerte celular cono. También, inducida farmacológicamente degeneración cono - por ejemplo el uso de inhibidores selectivos de la PDE6 - puede servir para identificar los mecanismos intermedios de 10,29,31 degeneración cono. En resumen, el protocolo descrito aquí permite la medición de Ca 2+ en compartimentos subcelulares de conos fotorreceptores ratón y presenta grandes oportunidades para descubrir la fisiología cono bajo una amplia gamade las condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Adicionalmente, este protocolo puede utilizarse para el cribado de agentes farmacológicos diseñados para interferir con el cono Ca 2 + -señalización y así ayudar a establecer nuevas terapias para las enfermedades de cono.

Visión inicia con la activación inducida por la luz de la cascada de fototransducción en los fotorreceptores de la retina. Fotorreceptores de varilla permiten la visión a bajos niveles de luz, mientras que los conos median color y de alta resolución de la visión diurna. Muchos genes específicos-fotorreceptoras son susceptibles a mutaciones que conducen a la degeneración de estas células. Un número de marcadores moleculares asociados con la pérdida de fotorreceptores se han identificado 1, pero hasta ahora los mecanismos moleculares detallados y la secuencia de eventos siguen sin estar claros. Altered Ca 2 + homeostasis se especuló a ser un desencadenante de la muerte celular de fotorreceptores, una hipótesis apoyada por la sobre regulación de la actividad de Ca 2+ proteasas de tipo calpaína dependientes durante el proceso de degeneración 2,3. Sin embargo, hasta la fecha, esta hipótesis no está respaldada por medidas fisiológicas de Ca 2+. Las inconsistencias en varios estudios sobre el efecto de los bloqueadores de los canales de Ca 2+ en reenfermedades intes- desafiaron aún más la participación de Ca 2+ en la muerte celular 4-6, llamando a métodos para evaluar directamente Ca 2+ en los conos de mamíferos. Anteriormente, la mayoría de la grabación eléctrica y estudios de imágenes de Ca 2+ se han realizado en modelos de anfibios y reptiles, debido a la facilidad de acceso a los conos de 7-9. Sin embargo, la fisiología de los mamíferos fotorreceptor puede ser diferente de la de los no mamíferos 10 y especialmente, en el contexto de la degeneración de la retina hereditaria humana, una mejor comprensión de la fisiología de los fotorreceptores de mamífero es una clave para el desarrollo de tratamientos innovadores. Muchos modelos de ratones que imitan enfermedades de la retina humanos están disponibles, pero se sabe poco sobre la dinámica de Ca2 + en los conos de ratones 11. Técnicas eléctricos no son adecuados para grabaciones de alto rendimiento de conos, en particular, no en ratones, donde varillas (~ 97%) superan en número significativamente conos (~ 3%) 12 </sarriba&gt;. Por otra parte, las técnicas electrofisiológicas sensibles como la de células enteras patch-clamp grabaciones perturban el medio intracelular y proporcionan datos sobre las corrientes de Ca2 +, pero no en absoluto intracelulares de Ca 2 + concentraciones. Por lo tanto, a pesar de la resolución temporal inferior, la imagen es el método de elección al abordar preguntas sobre cono Ca 2+ dinámica. La cuestión clave con imágenes es cómo etiquetar selectivamente los conos con una Ca 2 + colorante indicador fluorescente. Compartimentación adecuada y especificidad celular es difícil de lograr para el &quot;mayor carga&quot; sintético Ca 2+ colorantes indicadores en el tejido. Como consecuencia, los conos etiquetados, varillas 13,14, y las células gliales de Müller no se pueden distinguir de forma fiable. Además, los colorantes sintéticos tienden a filtrarse fuera de las células, impidiendo grabaciones prolongadas en condiciones compatibles. Además, cargando sintéticos Ca 2+ indicadores en su forma AM-éster es problemático, ya que requiere dedetergentes (por ejemplo, DMSO) y genera formaldehído 15. Para absolutos Ca 2+ mediciones, indicadores ratiometric son obligatorios. Sin embargo, el mejor indicador radiométrica sintético actualmente disponible Fura-2 requiere luz de excitación en el rango de 700 a 760 nm (para la excitación de dos fotones), que, dependiendo de su intensidad, puede en sí mismo estimular los conos, y así impedir los estudios de cono de Ca 2+ dinámica en condiciones de iluminación fisiológicas. A diferencia de los tintes sintéticos, genéticamente codificados Ca 2+ indicadores pueden expresarse de una manera selectiva de tipo celular. Que no se derramen fuera de las células, y por lo tanto, si se evita el blanqueado, mediciones ratiometric prolongados y fiables son posibles. Tipo selectivo celular expresión de Ca 2+ biosensores, cuando se combina con la microscopía de dos fotones, representa una poderosa herramienta para evaluar y estudiar subcelular Ca2 + en condiciones fisiológicas en gran medida 13,16,17 </sup&gt;. Aquí se describe un protocolo para estudiar la luz de estímulo-evocó cono Ca 2+ dinámica en un transgénico Ca 2+ línea biosensor ratón (HR2.1: TN-XL), que expresa la basada en FRET Ca 2+ biosensor TN-XL 18 selectivamente en conos, bajo la opsina roja promotor HR2.1 humana 19. Para acceder a los terminales de cono, se empleó una preparación rebanada ex vivo 20. El protocolo ya fue utilizado con éxito en tres estudios sobre la función de cono en ratones sanos 10,21,22. Por otra parte, el protocolo permite el estudio de Ca 2+ cono de señalización en condiciones genéticas específicas, por ejemplo, mediante el cruzamiento modelos de ratón para la degeneración retiniana hereditaria con HR2.1: ratones TN-XL.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1018817</td>
			<td><a href="http://www.dowcorning.com/">http://www.dowcorning.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades for tissue chopper</td>
			<td>MARTOR KG</td>
			<td>ARGENTAX No. 1044</td>
			<td>0.25 mm; http://www.martor.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>Custom-build</td>
			<td></td>
			<td>Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose filter membrane gridded</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AABG01300</td>
			<td>Filter type: 0.8 &#181;m; http://www.emdmillipore.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane CP</td>
			<td>CP pharma</td>
			<td>AP/DRUGS/220/96</td>
			<td><a href="http://www.cp-pharma.de/">http://www.cp-pharma.de</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/green LED-based full-field stimulator</td>
			<td>Custom-build</td>
			<td></td>
			<td>for details, see10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open source microprocessor board</td>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.arduino.cc/">http://www.arduino.cc</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software CfNT</td>
			<td>Custom-written</td>
			<td></td>
			<td>developed by Michael M&#252;ller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgorPro</td>
			<td>Wavemetrics</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.wavemetrics.com/">http://www.wavemetrics.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC3-4 System focal perfusion system</td>
			<td>ALA Scientific Instrument</td>
			<td></td>
			<td>with 100 &#956;m-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)</td>
			<td>Newport Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.spectra-physics.com/">http://www.spectra-physics.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Movable objective microscope (MOM), 
			Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html">http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPlanFL 20x/0.95w objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.olympusamerica.com/">http://www.olympusamerica.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer 100 series</td>
			<td>Surgivet</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.surgivet.com/">http://www.surgivet.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin, Calcium salt</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>I24222</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/">https://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>101191250</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ95</td>
			<td>leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.leica-microsystems.com/">http://www.leica-microsystems.com/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina

Los conos de la retina (conos) sirven visión diurna y son la base de la discriminación de color. Están sujetos a la degeneración, a menudo conduce a la ceguera en muchas enfermedades de la retina. El calcio (Ca 2+), un segundo mensajero clave en la señalización de los fotorreceptores y el metabolismo, se ha propuesto para ser indirectamente vinculado con degeneración de los fotorreceptores en diversos modelos animales. Estudiar sistemáticamente estos aspectos de la fisiología y patofisiología de cono ha sido obstaculizado por las dificultades de grabación eléctricamente de estas pequeñas células, en particular en el ratón, donde la retina está dominado por fotorreceptores de los bastones. Para evitar este problema, se estableció una de dos fotones Ca 2+ protocolo de imágenes utilizando una línea de ratón transgénico que expresa la codificada genéticamente Ca 2+ biosensor TN-XL exclusivamente en conos y puede ser cruzado con modelos de ratón de la degeneración de los fotorreceptores. El protocolo descrito aquí implica la preparación de secciones verticales (R20; rebanadas &quot;) de las retinas de ratones y de imágenes ópticas de los cambios de estímulo-evocó ligeras en cono de Ca 2+ nivel. El protocolo también permite &quot;medir durante el corte&quot; de absolutos Ca 2+ concentraciones; como las grabaciones pueden ser seguidos por calibración. Este protocolo permite a los estudios sobre las propiedades funcionales de cono y se espera que contribuya a la comprensión de cono de Ca2 + de señalización, así como la posible participación de Ca 2+ en la muerte de los fotorreceptores y la degeneración de la retina.

Al combinar las rebanadas verticales (Figura 1) preparado a partir de HR2.1: TN-XL retina del ratón con la imagen de dos fotones (Figura 2), hemos sido capaces de realizar mediciones radiométricas de luz Ca 2 + señales de estímulo-evocó en terminales de los axones fotorreceptoras cono . Este enfoque representa una mejora significativa en el acceso y la visualización de los conos de ratón sobre los métodos de formación de imágenes ópticas pre-existentes con sintéticos Ca 2+ indicadores. Por ejemplo, la expresión de cono específica del Ca radiométrica genéticamente codificado-2+ biosensor TN-XL facilita en gran medida la identificación de terminales de los axones de cono (ver ROIs en la Figura 3A). Por lo tanto, nuestro protocolo elimina el riesgo de señales de grabación de origen poco claro, como por ejemplo las señales &quot;mixtas&quot; con las contribuciones de ambos terminales del cono y axones varilla. Nuestro enfoque permite la resolución de las respuestas de una sola prueba en el nivel de la individual axón terminal de cono. Extrusión-Light evocado de Ca 2+ desde el terminal de cono está marcada por un aumento y una disminución de donante y aceptor de fluorescencia, respectivamente (Figura 3B). Disminución de la relación de fluorescencia (R) corresponde a la extrusión de Ca 2+ desde el terminal de cono (Figura 3C), causada por la hiperpolarización inducida por la luz del cono y el posterior cierre de canales de Ca2 + dependientes de voltaje. Debido a que varios terminales de los axones de cono se pueden monitorizar simultáneamente (Figura 3A), la adquisición de datos es muy eficiente y cientos de respuestas cono Ca 2+ puede ser recogido en un solo experimento. Mediante la evaluación de estas respuestas cuantitativamente (Figura 4), ​​de cono Ca 2 + señales pueden ser comparados y evaluados en una gama de condiciones (ver Discusión). A menudo es suficiente para utilizar la relación entre FRET-aceptor (citrino) y -donor (ECFP) de fluorescencia(F / F D; para más detalles, véase 3.4) como una medida relativa del nivel de Ca2 + intracelular. Sin embargo, siempre que sea necesario, la relación puede ser calibrado para obtener absolutos intracelulares de Ca 2 + concentraciones ([Ca2 +]) (Figura 5). En la iluminación de fondo utilizado en este protocolo (para más detalles, véase 10 y la Figura 3 la leyenda), calibración arrojó una estimación de absoluto reposo [Ca 2+] en &quot;tipo salvaje&quot; HR2.1: TN-XL terminales del cono de ratón de 243 ± 159 nM (media ± DE), que se encuentra dentro del rango reportado para ratones en la literatura 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig1.jpg" /> Figura 1. Preparación de rodajas de la retina verticales. (A) Aislada y aplanado retina preparado para rebanar. (B) el pedazo rectangular de retina (see cuadro rojo en A) montado en la membrana de papel de filtro (gris oscuro) después de rebanar. (C) Vista superior de la rebanada de la retina membrana montado en fijo sobre un cubreobjetos de vidrio con grasa. (D) Dibujo esquemático de una parte de una porción de la retina (véase el recuadro rojo en C). Fotorreceptores del cono se indican en verde. V ventral,; D, dorsal; N, nasal; T, temporal; OS, segmento externo; ONL, capa nuclear externa; OPL, la capa plexiforme externa; INL, capa nuclear interna; IPL, la capa plexiforme interna; GCL, capa de células ganglionares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig2.jpg" /> Figura 2. De dos fotones de imágenes de rebanadas de retina: Ilustración de la configuración de grabación superior:. Agua-inmersión lente objetivo centrar el seram del láser de barrido (flecha hacia abajo de color rojo) en la retina, y la recolección de la fluorescencia emitida (flechas hacia arriba). El objetivo también recoge transmite la luz infrarroja de un LED de iluminación montada debajo del condensador cuando imágenes de la rebanada utilizando una cámara CCD del centro:.. Rebanada de retina montado en la cámara de grabación y perfundido con solución extracelular inferior: lente de condensador enfocar la luz de los LEDs de estimulación (y el LED de infrarrojos para obtener imágenes de la cámara CCD) a través de la parte inferior transparente de la cámara de grabación en el tejido de la retina. IR LED, diodo emisor de luz infrarroja; CCD, dispositivo de carga acoplada; BP, de paso de banda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig3.jpg" /> Figura 3. Luz-evocarrespuestas d Ca 2+ en terminales de los axones de los conos del ratón. (A) Izquierda: Las grabaciones se centró en los terminales sinápticos (caja roja) de los conos (verde) en rebanadas de retina derecha:. Ejemplo para una región grabada con 7 terminales individuales. La fluorescencia se registró utilizando dos canales:. Una para el citrino FRET-aceptor (arriba; 535 BP 50) y uno para el FRET donantes ECFP (abajo; 480 BP 32) (B) los cambios de luz-evocado en citrino (F A) y ECFP (F D) registró la fluorescencia en un solo ROI. respuestas (C) Ca 2+ (como la relación F A / F D) de un terminal de cono a una serie de 1 seg brillantes destellos de luz en intervalos de 5 seg. ROI, región de interés; BP, filtro de paso de banda; F, la intensidad de fluorescencia; au, unidades arbitrarias; FRET, Förster transferencia de energía de resonancia; ECFP, mayor proteína fluorescente cian. La intensidad del estímulo (como ptasa oto-isomerización en 10 3 · P · s -1 por cono.): 13,0 y 12,8 por M y S-opsinas, respectivamente, añadiendo a un nivel de fondo (= LED apagado, escaneo láser de excitación) de ~ 10 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig4.jpg" /> Figura 4. Ejemplar análisis cuantitativo de cono de luz-evocó Ca 2 + respuestas (A) de Ca 2 + respuestas-Luz evocado (como? R) de un solo terminal de cono (ensayos individuales: rastros de color gris, n = 16; media:. Rastro negro ) (B) Los parámetros determinados para la media de Ca 2 + respuesta:. Descansar nivel del Ca2 + (base R) que representa la línea de base antes de la estimulación de la luz, el tamaño de la respuesta no es area-bajo-la-curva (R A) y amplitud de pico (R amp), la cinética de la aparición de la respuesta (t subida, intervalo de tiempo desde 20% a 80% de R amp) y el desplazamiento (t decaimiento, intervalo de tiempo desde 80% al 20% de R amp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig5.jpg" /> Figura 5. Estimación de absoluta concentración de Ca 2+. Descansar concentración de Ca2 + ([Ca 2 +], como la relación F A / F D) registrados en terminales de los axones 8 cono en un ratón TN-XL (círculos, con una media ± DE) para diferentes soluciones extracelulares: dos veces en medio extracelular estándar (Ctrl 1 y 2), a continuación, con un mínimo (&quot;cero&quot;) [Ca 2 +] (mM EGTA 10) und con alta [Ca 2 +] (2,5 mM), las dos últimas condiciones en presencia de 5 mM ionomycin equilibrar extracelular e intracelular de Ca 2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Se describe un protocolo para supervisar Ca 2+ dinámica en los terminales de los axones de los conos utilizando una preparación rebanada ex-vivo de la retina del ratón. Este protocolo permite estudios completos sobre los conos de señalización de Ca2 + en un importante sistema modelo de mamífero, el ratón.

Imagen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dinámica de Terminales cono fotorreceptor axón de la retina del ratón

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

imaging-ca2-dynamics-cone-photoreceptor-axon-terminals-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

10.5K vistas.  University of Tübingen.  Se describe un protocolo para supervisar Ca 2+ dinámica en los terminales de los axones de los conos utilizando una preparación rebanada ex-vivo de la retina del ratón. Este protocolo permite estudios completos sobre los conos de señalización de Ca2 + en un importante sistema modelo de mamífero, el ratón. 

Video: Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp mediciones de capacitancia y Ca 2 + Imágenes en las terminaciones nerviosas individuales en rebanadas de retina

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Investigación

Neurociencias

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

Transretinal Grabaciones ERG de retina del ratón: Rod y el Cono Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

Uso De pHluorin Para Evaluar La Dinámica De Los Receptores De Orientación Axón En El Cultivo Celular Y En El Embrión De Polluelo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Evaluación de la Vascular regeneración en el SNC Utilizando la retina del ratón

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

Visualización de la Dinámica en Endosoma Vivir terminaciones nerviosas con imágenes de fluorescencia en cuatro dimensiones

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome Seccionamiento retina del ratón para preparar cultivos de fotorreceptores

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Todo el montaje de imágenes de embriones de ratón Proyecciones sensorial Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervioso entérico

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...