Agradecemos a los programadores de Hamilton y especialistas de apoyo y Blaas Eva de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por dos Ayudas a la inversión del Nuevo Orden Mundial (911-07-031 y 40-00506-98-10011), El Prinses Beatriz Fonds Wetenschapsprijs 2009 y el Campus de Neurociencias de Amsterdam, SJ con el apoyo de Ti-Pharma: T5-207.

1. Automatizado de células adherentes proceso de cultivo (Figura 1) 20 <ol><li> Prepare el sistema de cultivo de células automatizado para la entrada de las placas de cultivo celular. Consumibles de carga (por ejemplo, puntas de pipeta, placas de cultivo celular, placas de ensayo) en el sistema utilizando la interfaz gráfica de usuario (GUI). Asegúrese de que hay suficientes medios de cultivo celular, tampón fosfato salino (PBS) y tripsina en el sistema robótico. </li><li> Manual de la semilla dos placas omnitray con 2 x 10 6 células por placa, de la línea de neuroblastoma SH-SY5Y células. Mantener las células en Opti-MEM con 10% de suero fetal bovino (SFB). Poner los platos en el robot de cultivo celular mediante la GUI. Las células se incubaron a 37 º C y 5% CO 2. </li><li> Elegir qué protocolo de cultivo celular debe iniciarse 20. Uno puede elegir entre un proceso de cultivo de células adherentes 22, el cultivo y la expansión de células madre embrionarias (ES) las células en células alimentadoras del ratón 23 o el cultivo de la suspensión cells 22. </li><li> Seleccione el protocolo de cultivo de células adherentes (Figura 1) y asegurar la adherencia archivos de la línea celular específica de parámetros se ajustan de manera que el umbral de confluencia (el área de la placa omnitray que contiene las células) se ha fijado en 70%. Establecer el tiempo total de tripsinización a dos minutos. </li><li> Instruir al robot para preparar nuevos platos omnitray, con un número de células de siembra de 2 x 10 6 células por placa. </li><li> Platos de entrada omnitray en el sistema de cultivo celular utilizando el protocolo automatizado de cultivo de células adherentes (Figura 1). Este protocolo incluye los siguientes pasos: las placas se incuban y la imagen hasta llegar al umbral de confluencia pre-definidos. Si las células no alcanzan el umbral de confluencia dentro de los 5 lecturas, las placas se eliminan del sistema. Al llegar a la confluencia del umbral definido por el usuario, se lavan las células, y contó con tripsina. Un determinado número de células se añaden a las placas de omnitray nuevo y si hay un número suficiente de células, una insensible especificadoer de placas de ensayo son transportados a la cubierta y un número determinado de células en cada pocillo. Las placas de ensayo puede ser fotografiado directamente con el microscopio integrado o salida del sistema para su posterior procesamiento. </li><li> Indicar al sistema que preparar 4 placas de ensayo por placa omnitray, con un total de 5.000 células por pocillo. </li></ol> 2. ARNhc la producción de virus y de las planchas en las placas de ensayo (Tiempo: 6 días) <ol><li> Crecen las poblaciones bacterianas de glicerol que contiene los vectores shRNA (Open Biosystems, TRC1) durante la noche en 2 ml de los medios de comunicación medio Luria-Bertani conteniendo 100 mg / ml de ampicilina (Sigma-Aldrich). </li><li> Extracto de plásmidos siguiendo el protocolo del fabricante (Promega Asistente MagneSil TFX). </li><li> Producir virus con el Consorcio de RNAi de alto rendimiento de la producción lentivirales (96 pocillos) el protocolo 24. Trabajar con lentivirus es relativamente seguro, porque las partículas de virus para la transducción de la replicación son deficientes y de divisiónestrategias gen de embalaje se utilizan para su producción. Sin embargo, cuando se trabaja con lentivirus, los procedimientos de bioseguridad adicionales son necesarias para reducir al mínimo el riesgo para uno mismo y los demás 25. Todos los experimentos deben realizarse en un laboratorio de nivel MLII o BSL2 seguridad. Todos los plásticos (pipetas, platos de plástico, los medios de comunicación) que han estado en contacto con partículas de lentivirus se incuban con cloro durante 24 horas antes de su eliminación. </li><li> Calcular la multiplicidad de infección (MOI) de los lentivirus, determinando el porcentaje de células GFP positivos con el plásmido GFP pLKO.1 (Sigma-Aldrich). </li><li> Placa de lentivirus en las placas de ensayo, con una MOI de 3. </li></ol> 3. Transducción de lentivirus y la diferenciación neuronal de células SH-SY5Y (Tiempo: 6 días) <ol><li> Las células se añaden a las placas de ensayo (véase el paso 1.7). De carga placas de ensayo que contienen lentivirus ARNhc en el sistema de cultivo de células automatizado. </li><li> Después de 24 horas, los medios de comunicación en laplacas de ensayo se cambiará a Opti-MEM que contiene 0,5% de SFB y 0,1 M de ácido retinoico para iniciar el proceso de diferenciación. La diferenciación de las células SH-SY5Y permite la visualización de las estructuras neuríticas y sincroniza la división celular. </li><li> Continuar la incubación de las placas de ensayo en los medios de diferenciación, durante 5 días. Esto asegura la máxima caída de la expresión del gen diana. </li><li> El día 5, se añaden 50 mM H 2 O 2 a la mitad de las placas de ensayo durante 24 horas para estimular la translocación de DJ1 a la mitocondria. </li><li> El día 6, añadir CmxROS Mitotracker (Invitrogen) a las células a una concentración final de 200 nM por pocillo y se incuba a 37 ° C durante 30 minutos. </li><li> Se puede indicar al sistema que las placas de imagen directamente usando la cámara de HC o placas se pueden exportar desde el sistema para su posterior procesamiento. </li></ol> 4. Inmunotinción automatizado de placas de ensayo (Tiempo: 2 días) La calidad de imagen es paramount para la realización de una sensible y fiable HCS. El daño a la monocapa celular, debido a pipeteo inexacto puede conducir a mala calidad de imagen y resultados irreproducibles. Con el fin de minimizar el daño de la capa celular, la inmunotinción se realizó utilizando una estación robótica. El procedimiento es similar a uno que ha sido descrito previamente 26, pero se ha personalizado para aumentar el rendimiento y reducir el uso de consumibles. <ol><li> Fijar las células con 100 l de paraformaldehído al 4% de pre-calentado a 37 ° C. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células con 200 l de PBS durante 5 minutos, 3 veces. </li><li> Incubar las placas de ensayo con 200 l de PBS que contenía 0,1% de Triton (PBST) durante 10 minutos. </li><li> Lavar las células con 200 l de PBS durante 5 minutos, 3 veces. </li><li> Incubar las placas de ensayo con 200 l de buffer de bloque (PBST con FBS al 5%) durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células con 200 l de PBS durante 5 minutos, 3 veces. </li><li> Incubar con el ejerdebido anticuerpos primarios noche a 4 ° C: <ol><li> Cabra DJ1 N20 (Santa Cruz, 5 mg / ml) </li><li> Conejo β-tubulina III (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) </li></ol></li><li> Al día siguiente, lavar las células con 200 l de PBS durante 5 minutos, 3 veces. </li><li> Incubar las placas de ensayo con los siguientes anticuerpos secundarios de 1 hora a temperatura ambiente: <ol><li> AlexaFluor 488 burro anti-cabra (Invitrogen, 2 mg / ml) </li><li> AlexaFluor 647 cabra anti-conejo (Invitrogen, 2 mg / ml </li></ol></li><li> Lavar las células con 200 l de PBS durante 5 minutos, 3 veces. </li><li> Las células se incuban con Hoechst (Invitrogen, 1 mg / ml) durante 10 minutos. </li><li> Lavar las células con 200 l de PBS durante 5 minutos, 3 veces. </li><li> Las placas se almacenan a 4 ° C hasta que se pueden obtener imágenes. </li></ol> 5. Imagen de alto contenido de adquisición y análisis de imágenes (Tiempo: 5 días) <ol><li> Imagen de un total de 30 campos por bien con la lente del objetivo de 20x. Visualizar DJ1 con la FITC conjunto de filtros, la mitocondria con el conjunto de filtros TRITC, β-tubulina III con el conjunto de filtros Cy5 y los núcleos utilizando el conjunto de filtro UV (Figura 3). </li><li> Analizará las imágenes utilizando el Bioapplication análisis compartimental (Cellomics, ThermoFisher) para determinar la intensidad media de la señal de Mitotracker dentro de las mitocondrias. (Figura 4 B, F). </li><li> Para determinar el coeficiente promedio de superposición entre DJ1 y las mitocondrias, analizará las imágenes utilizando el bioapplication colocalización Cellomics (Cellomics, ThermoFisher). Definir regiones de interés (ROI) de la siguiente manera: Un retorno de la inversión - el núcleo (Figura 4 A, E), retorno de la inversión B - las mitocondrias (Figura 4 B, F). Excluir a un retorno de la inversión de retorno de la inversión B para asegurar un análisis de sólo el citoplasma. Definir la mitocondria como región objetivo I y DJ1 como objetivo la II Región (Figura 4 C, G). </li><li> Analizará las imágenes utilizando el bioapplication perfiles neuronales (Cellomics, ThermoFisher) para rastrear la longitud media de las neuritas de la tinción de la tubulina β-III (Figura4D, H). </li><li> Placas de imagen con la Opera LX automático confocal lector (Perkin-Elmer). Imagen de un total de 30 campos por bien con la lente del objetivo 60x con inmersión en agua. Visualizar las mitocondrias con el láser de 561 nm y los núcleos de excitación UV. </li><li> Analizará las imágenes utilizando el Spot-Edge-Ridge (SER), con textura algoritmo características. El filtro de SER-Ridge transmite la intensidad de píxeles que forman como patrones de canto. Cuanto más fragmentado de la mitocondria, mayor será la puntuación SER-Ridge (Figura 8). </li></ol> 6. La normalización de datos y análisis <ol><li> Importar los datos desde el software de análisis de imagen en el BioConductor CellHTS2 paquete para el entorno de software R (R versión 2.11.1, la versión BioConductor 2.6). </li><li> Logaritmo de base (2) transformar los datos antes de la placa por medio de normalización basado en 27, 28. No aplique el ajuste de variación por placa. </li><li> Para identificar los modificadores del fenotipo, utilizar un ANOVA de dos vías entre los diferent grupos de tratamiento, es decir las células no tratadas infectadas revueltos vs revueltos células tratadas frente a la toxina células diana del gen no tratados frente a las células diana del gen tratado (figuras 5-7). </li></ol> 7. Los resultados representativos Las mutaciones en DJ1 dar lugar a la aparición temprana-recesivo parkinsonismo 21, pero no está claro cómo la pérdida de DJ1 da lugar al fenotipo de la enfermedad. Se sabe que las células deficientes de DJ1 son más susceptibles a la muerte celular oxidativo inducido por el estrés y en respuesta al estrés oxidativo, DJ1 transloca desde el citoplasma a la mitocondria 29, 30. Mediante la construcción de los ensayos de HC para controlar estos fenotipos, podemos identificar los genes que regulan o afectan fenotipos asociados a DJ1. Este enfoque puede ayudar a descifrar los caminos dentro de la cual DJ1 funciones y que podrían estar involucrados en la patogénesis de la enfermedad. Ejemplo de una interacción con epistáticos DJ1 (Figura 5): Derribo de DJ1 en las células expuestascon los resultados de toxinas en una mayor pérdida de la viabilidad celular (BAR-B: imagen-B) en comparación con las células infectadas con revueltos lentivirus (BAR-A: imagen-A). Derribo de un gen diana tiene un efecto similar a la observada en las células con una caída DJ1 (BAR-C: imagen-C). Derribo de dos DJ1 y un gen diana resulta en una pérdida mucho mayor de la viabilidad celular de la pérdida de genes, ya sea solo (BAR-D:-D la imagen). Esto sugiere una interacción entre epistáticos DJ1 y la meta de genes A. Ejemplo de un gen regulador DJ1 translocación (Figura 6): Cuando las células son expuestas a una toxina, DJ1 transloca desde el citoplasma a las mitocondrias, que se cuantifica mediante un coeficiente más elevado solapamiento entre DJ1 y las mitocondrias (BAR-A: A versus imagen BAR-C: la imagen C). En las células B, donde ha sido la meta de genes silenciados, menos DJ1 transloca a la mitocondria en las células son expuestas a la toxina. Esto sugiere que el objetivo B gen está involucrado en el transporte de DJ1 a la mitocondria. (BAR-B:<html> imagen B y D-BAR: la imagen D) Ejemplo de un gen involucrado en consecuencia neuronal (Figura 7): Derribo de C del gen diana en el medio silvestre de tipo SH-SY5Y células da como resultado un aumento significativo de la duración de neuritas (BAR-B: imagen-B) en comparación con las células infectadas por lentivirus que expresan revueltos shRNA (BAR-A: imagen A). Este efecto se pierde en las células incubadas con la toxina (BAR-C y D). Ejemplo de un gen involucrado en la morfología mitocondrial (Figura 8): La infección de tipo salvaje células SH-SY5Y con ARNhc objetivo gen D produce una disminución en el valor de la segmentación mitocondrial SER-Ridge (Figura 8, C y D de la imagen) en comparación con las células infectadas por lentivirus revueltos (Figura 8, A y B de la imagen). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig1_lg.jpg"><img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig1.jpg" /></a> Figura 1 Esquema del protocolo automatizado de cultivo de células.: ntent &quot;&gt; <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig2_lg.jpg"><img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig2.jpg" /></a> Figura 2 Presentación esquemática del proceso de selección, análisis de imágenes y los métodos estadísticos utilizados durante el proceso de selección:. I) Las células se cultivan hasta que son confluentes y posteriormente sembraron en las placas de ensayo que contiene los lentivirus shRNA. Las células se diferencian durante 5 días y la toxina se añade a las placas durante 24 horas. Las placas de ensayo se emiten desde el sistema y immunostained. La cantidad de tiempo necesario para que cada uno de los procesos se indica entre paréntesis. ii) Los datos se realiza a través una cámara HC (la viabilidad celular, la translocación de proteínas y extensión neuronal) y un sistema automatizado de imágenes confocal (morfología mitocondrial). Los datos son exportados a CellHTS2 paquete en R, base (2) transformación logarítmica y normalizado. ANOVA de dos vías se utiliza para identificar las interacciones significativas entre las diferentes variables. Figura 3. Composiciones de imágenes de células adquirida por HC imágenes. A) Las células no tratadas, B) Las células tratadas con H 2 O 2. DJ1 tiene la etiqueta de color verde, las mitocondrias en rojo y los núcleos en azul. Tinción neuritas no está resaltado. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig4.jpg" /> Figura 4. Cuantificación de varias funciones celulares obtenidos a partir de una HCS. AD) no se trata SH-SY5Y células. EH) H 2 O 2 tratados con las células SH-SY5Y. A, E) Los núcleos de segmentación y definición de retorno de la inversión A, B, F) Identificación y cuantificación de las mitocondrias B, retorno de la inversión, C, G) Identificación de DJ1, Target del canal II, D, G) La identificación y el cálculo de la longitud de las neuritas promedio. Las células cerca de la orilla de la imagen son excluidos del análisis. Imágenes en los recuadros son las imágenes antes del análisis. <imgalt = &quot;la figura 5.&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3452/3452fig5.jpg&quot; /&gt; Figura 5. La identificación de un gen en epistasis con DJ1 (letras en las barras corresponden a las letras en las imágenes). Imágenes de la A a D son SH-SY5Y células marcadas con Mitotracker CMXRos (rojo) que se utilizó para la cuantificación de la salud celular. <img alt="Figura 6." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig6.jpg" /> Figura 6. La identificación de un gen regulador DJ1 translocación (letras en las barras corresponden a las letras en las imágenes). Imágenes de la A a D son SH-SY5Y células marcadas por DJ1 (verde), las mitocondrias (rojo) y núcleos (azul) que se utilizaron para la cuantificación de DJ1 translocación a la mitocondria. <img alt="Figura 7." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig7.jpg" /> Figura 7. Identificación de un gen involucrado en consecuencia neuronal (letras en las barras corresponden a las letras en las imágenes). Imágenes de la A a D son SH-SY5Y células marcadas para la β-tubulina III (verde) y núcleos (azul) que se utiliza para la cuantificación de la longitud de las neuritas. <img alt="Figura 8." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig8.jpg" /> Figura 8. La identificación de un gen implicado en la regulación de la morfología mitocondrial. Imagen de A y C son imágenes compuestas de SH-SY5Y células infectadas con revuelto ARNhc o un objetivo del shRNA gen D, respectivamente. Las mitocondrias son de color rojo, mientras que los núcleos son de color azul. Imagen B y D son las visualizaciones de la cuantificación SER-Ridge.

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	<li>Geschwind, D. H., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+in+the+era+of+functional+genomics+and+systems+biology.">Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology.</a> Nature. 461, 908-915 (2009).</li><li>Ge, H., Walhout, A. J., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+'omic'+information:+a+bridge+between+genomics+and+systems+biology.">Integrating 'omic' information: a bridge between genomics and systems biology.</a> Trends. Genet. 19, 551-560 (2003).</li><li>Zhu, H., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Omic'+approaches+for+unraveling+signaling+networks.">'Omic' approaches for unraveling signaling networks.</a> Curr. Opin. Cell. Biol. 14, 173-179 (2002).</li><li>Jain, S., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+single+genes+to+gene+networks:+high-throughput-high-content+screening+for+neurological+disease.">From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease.</a> Neuron. 68, 207-217 (2010).</li><li>Manolio, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+missing+heritability+of+complex+diseases.">Finding the missing heritability of complex diseases.</a> Nature. 461, 747-753 (2009).</li><li>Nalls, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imputation+of+sequence+variants+for+identification+of+genetic+risks+for+Parkinson's+disease:+a+meta-analysis+of+genome-wide+association+studies.">Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies.</a> Lancet. 377, 641-649 (2011).</li><li>Simon-Sanchez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+confirms+extant+PD+risk+loci+among+the+Dutch.">Genome-wide association study confirms extant PD risk loci among the Dutch.</a> Eur. J. Hum. Genet. 19 (6), 655-661 (2011).</li><li>Van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductionism+and+complexity+in+molecular+biology.+Scientists+now+have+the+tools+to+unravel+biological+and+overcome+the+limitations+of+reductionism.">Reductionism and complexity in molecular biology. Scientists now have the tools to unravel biological and overcome the limitations of reductionism.</a> EMBO. Rep. 5, 1016-1020 (2004).</li><li>Aherne, G. W., McDonald, E., Workman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+needle+in+the+haystack:+why+high-throughput+screening+is+good+for+your+health.">Finding the needle in the haystack: why high-throughput screening is good for your health.</a> Breast. Cancer. Res. 4, 148-154 (2002).</li><li>An, W. F., Tolliday, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction:+cell-based+assays+for+high-throughput+screening.">Introduction: cell-based assays for high-throughput screening.</a> Methods. Mol. Biol. 486, 1-12 (2009).</li><li>Mayr, L. M., Bojanic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+trends+in+high-throughput+screening.">Novel trends in high-throughput screening.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 580-588 (2009).</li><li>Hertzberg, R. P., Pope, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening:+new+technology+for+the+21st+century.">High-throughput screening: new technology for the 21st century.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 445-451 (2000).</li><li>Conrad, C., Gerlich, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+microscopy+for+high-content+RNAi+screening.">Automated microscopy for high-content RNAi screening.</a> J. Cell. Biol. 188, 453-461 (2010).</li><li>Thomas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening:+a+decade+of+evolution.">High-content screening: a decade of evolution.</a> J. Biomol. Screen. 15, 1-9 (2010).</li><li>Arrasate, M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+microscope+system+for+determining+factors+that+predict+neuronal+fate.">Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3840-3845 (2005).</li><li>Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+analysis+in+neuroscience.">High-content analysis in neuroscience.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9, 779-788 (2008).</li><li>Varma, H., Lo, D. C., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+neurodegeneration+and+complex+disease+phenotypes.">High throughput screening for neurodegeneration and complex disease phenotypes.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 238-248 (2008).</li><li>Durr, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+hit+identification+by+quality+assurance+and+multivariate+data+analysis+of+a+high-content,+cell-based+assay.">Robust hit identification by quality assurance and multivariate data analysis of a high-content, cell-based assay.</a> J. Biomol. Screen. 12, 1042-1049 (2007).</li><li>Miller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+relationships+between+huntingtin+levels,+polyglutamine+length,+inclusion+body+formation,+and+neuronal+death+provide+novel+insight+into+huntington's+disease+molecular+pathogenesis.">Quantitative relationships between huntingtin levels, polyglutamine length, inclusion body formation, and neuronal death provide novel insight into huntington's disease molecular pathogenesis.</a> J. Neurosci. 30, 10541-10550 (2010).</li><li>Jain, S., Sondervan, D., Rizzu, P., Bochdanovits, Z., Caminada, D., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+Automation+of+Cell+Culture.">The Complete Automation of Cell Culture.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (8), (2011).</li><li>Bonifati, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+DJ-1+gene+associated+with+autosomal+recessive+early-onset+parkinsonism.">Mutations in the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onset parkinsonism.</a> Science. 299, 256-259 (2003).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsinizing+and+Subculturing+Mammalian+Cells.">Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e755-e755 (2008).</li><li>Kent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Maintenance+of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).</li><li>Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentiviral+RNAi+library+for+human+and+mouse+genes+applied+to+an+arrayed+viral+high-content+screen.">A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen.</a> Cell. 124, 1283-1298 (2006).</li><li>Volksgezondheid, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrale+versie+van+de+Regeling+genetisch+gemodificeerde+organismen+en+het+Besluit+genetische+gemodificeerde.">Integrale versie van de Regeling genetisch gemodificeerde organismen en het Besluit genetische gemodificeerde.</a> Organismen. , (2004).</li><li>Anderl, J. L., Redpath, S., Ball, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neuronal+and+Astrocyte+Co-Culture+Assay+for+High+Content+Analysis+of+Neurotoxicity.">A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity.</a> J. Vis. Exp. (27), e1173-e1173 (2009).</li><li>Wiles, A. M., Ravi, D., Bhavani, S., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+normalization+methods+for+Drosophila+RNAi+genomic+screens+and+development+of+a+robust+validation+scheme.">An analysis of normalization methods for Drosophila RNAi genomic screens and development of a robust validation scheme.</a> J. Biomol. Screen. 13, 777-784 (2008).</li><li>Canet-Aviles, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+DJ-1+is+neuroprotective+due+to+cysteine-sulfinic+acid-driven+mitochondrial+localization.">The Parkinson's disease protein DJ-1 is neuroprotective due to cysteine-sulfinic acid-driven mitochondrial localization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 9103-9108 (2004).</li><li>Blackinton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+stabilized+cysteine+sulfinic+acid+is+critical+for+the+mitochondrial+function+of+the+parkinsonism+protein+DJ-1.">Formation of a stabilized cysteine sulfinic acid is critical for the mitochondrial function of the parkinsonism protein DJ-1.</a> J. Biol. Chem. 284, 6476-6485 (2009).</li><li>Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+selective+inhibitors+of+cancer+stem+cells+by+high-throughput+screening.">Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening.</a> Cell. 138, 645-659 (2009).</li><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+multiple+synthetic+lethal+interactions+with+the+Ras+oncogene.">A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene.</a> Cell. 137, 835-848 (2009).</li><li>Mouchet, E. H., Simpson, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+in+oncology+drug+discovery:+opportunities+and+challenges.">High-content assays in oncology drug discovery: opportunities and challenges.</a> IDrugs. 11, 422-427 (2008).</li><li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 238, 656-663 (2009).</li><li>Pardo-Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. (40), e1900-e1900 (2010).</li><li>Ross, P. J., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+complex+neuropsychiatric+disease+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling complex neuropsychiatric disease with induced pluripotent stem cells.</a> F1000. Biol. Rep. 2, 84-84 (2010).</li><li>Ebert, A. D., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+and+drug+screening:+opportunities+and+challenges.">Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 9, 367-372 (2010).</li><li>An, W. F., Tolliday, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+assays+for+high-throughput+screening.">Cell-based assays for high-throughput screening.</a> Mol. Biotechnol. 45, 180-186 (2010).</li></ol>

No tenemos nada que revelar

Con la disminución de los costos de HT / HC sistemas de selección celular, combinadas con la disponibilidad de potentes herramientas de todo el genoma para modificar la función del gen, HT / HC pantallas son cada vez más comunes en el mundo académico. El enfoque ha sido aplicado con éxito en diversas áreas de investigación tales como la identificación de dianas terapéuticas en el cáncer de 9, 31-33 y 34-36 el desarrollo embrionario e incluso tiene un gran potencial para su aplicación en el desciframiento de las vías implicadas en los trastornos neuropsiquiátricos 37,38. Sin embargo la aplicación de este sistema requiere una importante inversión de tiempo y esfuerzo con la optimización de procesos a menudo tomar un mínimo de 6 meses. Todos los pasos, como los tiempos de tripsinización, las velocidades de pipeteado y densidades de siembra deben ajustarse, para asegurar que las células están sanas y crecen constantemente. Prevención de la contaminación bacteriana es uno de los retos más difíciles que enfrenta el cultivo de células automatizado con los protocolos de limpieza semanal en combination con lavado constante de todas las líneas de orientación líquido con etanol al 70% que sea necesaria para los cultivos libres de contaminación. También será necesario mejorar la robótica, para que otros instrumentos, como microscopios confocal de alta resolución y -80 ° C congeladores para el almacenamiento de compuestos pueden ser integrados. También hay limitaciones que deben ser abordados para mejorar la velocidad sensible, y la utilidad de este método para estudiar las redes de genes e identificar los genes implicados en las vías patógenas molecular. Para llevar a cabo una pantalla de HT / HC y asegurar que los datos fiables se recogen varios aspectos que deben optimizarse. En primer lugar, la fiabilidad de la medición es de suma importancia y depende de la solidez y la sensibilidad del ensayo. Por ejemplo, los ensayos descritos anteriormente son adecuados para pantallas más pequeñas, pero son difíciles de implementar en una escala amplia del genoma, debido a los pasos de procesamiento número requerido antes de la adquisición de imágenes.Por lo tanto, habría que construir líneas celulares estables que expresan el gen reportero, lo que permitiría obtener imágenes directas y conducir a una variación disminuido debido a la reducción del número de pasos de procesamiento. En la actualidad, el diseño de un ensayo que describe con precisión y fiabilidad cuantifica un fenotipo de interés es un importante cuello de botella en el proceso de selección de HC. Muchas pantallas se llevan a cabo en células de mamíferos utilizando diferentes bibliotecas de RNAi, que sufren de los efectos fuera del objetivo, la eficacia limitada de silenciamiento génico y la cobertura del genoma incompleto. Así, las bibliotecas deben ser más específicas, potentes y tienen una mejor cobertura. Se están realizando esfuerzos para crear tales se espera que esos esfuerzos mejorarán la reproducibilidad de HT / HC SCRE<html> en hits. Una de las limitaciones de muchas pantallas de gran escala basada en células es que se llevan a cabo en células de neuroblastoma, ya que puede ser manipulada genéticamente y se cultivan para un gran número con relativa facilidad. Sin embargo, la relevancia de los &quot;hits&quot; identificados en el ex modelos in vivo de cultivo celular para la función in vivo es cuestionable, especialmente porque el cerebro se compone de tipos de células altamente especializadas que forman una red densa y compleja de conexiones sinápticas a funcionar como una unidad altamente integrada. Como consecuencia de ello, es común que llega a identificarse con el método de detección se ha descrito anteriormente, se validan en las pantallas secundarias mediante técnicas adicionales y en los modelos más fisiológicos relevantes 39. Para mejorar la traducción de accesos identificados durante HCS, los modelos más representativos y sofisticados, tales como células primarias y células diferenciadas, madre o de los sistemas de co-cultivo deben ser desarrollados y adaptados para HT / HC enfoques. ntent &quot;&gt; Con una combinación de cultivo de células automatizado y HC imágenes un rápido puede tener nuevas ideas en función de cómo las neuronas y determinar las vías que son importantes para el desarrollo de la enfermedad. La combinación de HCS / HTS de datos con información generada desde otros enfoques&quot; ómicas &quot;, que se entonces sería posible construir una visión de la biología de sistemas enfermedades del cerebro, lo que facilita el desarrollo terapéutico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> AI.CELLHOST </td><td> HAMILTON </td><td> <a href="http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/">http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/</a> </td></tr><tr><td> OPTI-MEM </td><td> INVITROGEN </td><td> 31985-054 </td></tr><tr><td> Ácido retinoico </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> OMNITRAY PLACAS </td><td> NUNC </td><td> 465219 </td></tr><tr><td> 96 placas de cultivo BIEN </td><td> GRENIER </td><td> 655086 </td></tr><tr><td> DJ1 N20 ANTICUERPOS </td><td> SANTA CRUZ </td><td> SC27004 </td></tr><tr><td> BETA-III tubulina anticuerpo </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> T3952 </td></tr><tr><td> CMXROS MitoTracker </td><td> INVITROGEN </td><td> M-7512 </td></tr><tr><td> Hoechst-33342 </td><td> INVITROGEN </td><td> H1399 </td></tr><tr><td> PERÓXIDO DE HIDRÓGENO </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> 216763-100ML </td></tr><tr><td> TRIPSINA </td><td> INVITROGEN </td><td> 25050014 </td></tr><tr><td> Fosfato de Dulbecco solución salina tamponada </td><td> INVITROGEN </td><td> 14190086 </td></tr><tr><td> PROMEGA WIZARD MagneSil TFX </td><td> PROMEGA </td><td> A2380 </td></tr><tr><td> ARNhc CLONES </td><td> Open Biosystems </td><td> <a href="http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/TRCLibraryDetails/">http://www.openbiosystems</a>.com / RNAi / shRNALibraries / TRCLibraryDetails / </td></tr><tr><td> CELLOMICS BIOAPPLICATIONS </td><td> THERMO-FISHER </td><td> <a href="http://www.thermo.com/hcs">http://www.thermo.com/hcs</a> </td></tr></tbody></table>

high content screening in neurodegenerative diseases

La anotación funcional de los genomas, la construcción de las redes moleculares y la identificación de nuevos objetivos farmacológicos, son retos importantes que deben abordarse como un asunto de gran urgencia 4.1. Múltiples enfoques complementarios &quot;ómicas&quot; han dado pistas sobre los factores de riesgo genéticos y mecanismos patogénicos subyacentes numerosas enfermedades neurodegenerativas, pero la mayoría de los resultados aún requieren validación funcional 5. Por ejemplo, un reciente estudio del genoma de asociación amplia de la enfermedad de Parkinson (EP), identificado loci muchos de los nuevos factores de riesgo de la enfermedad, pero la variante causal subyacente (s) o mecanismo patogénico no se conoce 6, 7. A medida que cada región asociada puede contener varios genes, la evaluación funcional de cada uno de los genes en los fenotipos asociados con la enfermedad, utilizando las técnicas tradicionales de la biología celular sería demasiado larga. También hay una necesidad de entender las redes moleculares que vinculanmutaciones genéticas que causan los fenotipos. Se espera que los fenotipos de la enfermedad son el resultado de múltiples interacciones que se han interrumpido. La reconstrucción de estas redes con los métodos tradicionales molecular llevaría mucho tiempo. Por otra parte, las predicciones de la red de estudios independientes de los componentes individuales, el enfoque reduccionista, es probable que subestimar la complejidad de la red 8. Esta subestimación podría, en parte, explicar la baja tasa de éxito de la aprobación del medicamento debido a efectos secundarios indeseables o tóxicos. Obtener una perspectiva de la red de caminos de la enfermedad relacionada con HT / HC métodos de selección celular, y la identificación de los nodos clave dentro de estas vías, podría conducir a la identificación de objetivos que son más adecuadas para la intervención terapéutica. Selección de alto rendimiento (HTS) es una metodología ideal para tratar estos temas 9-12. pero los métodos tradicionales de una sola dimensión integral y ensayos celulares, que utilizan simstic lecturas de los procesos biológicos complejos. No fueron capaces de cuantificar de forma simultánea los fenotipos observados en muchas enfermedades neurodegenerativas como el déficit en el transporte axonal o alteraciones en la morfología de 13 propiedades, 14. Este enfoque no puede ser utilizado para investigar la naturaleza dinámica de los procesos celulares o eventos patogénicos que ocurren en un subconjunto de las células. Para cuantificar estas características hay que pasar a la multi-dimensional fenotipos denominados de alto contenido de detección (HCS) 4, 15-17. HCS es la cuantificación basada en células de varios procesos simultáneamente, lo que proporciona una representación más detallada de la respuesta celular a diversas perturbaciones en comparación con el HTS. HCS tiene muchas ventajas sobre HTS 18, 19, pero la realización de un alto rendimiento (HT), de alto contenido (HC) en la pantalla de los modelos neuronales es problemático debido a los altos costos, la variación ambiental y el error humano. Con el fin de detectar la respuesta celular en un &#39;phenomics&#39; escalacon HC imagen que uno tiene que reducir la variación y error, al tiempo que aumenta la sensibilidad y reproducibilidad. En este documento se describe un método para llevar a cabo con precisión y fiabilidad pantallas ARNhc con el cultivo de células automatizado 20 y HC de imágenes neuronales en modelos celulares. Se describe la forma en que han utilizado esta metodología para identificar moduladores de una proteína en particular, DJ1, que cuando está mutado causa parkinsonismo autosómico recesivo 21. La combinación de la versatilidad de la HC de imágenes con los métodos de HT, es posible cuantificar con precisión una gran cantidad de fenotipos. Esta tarde podría ser utilizado para avanzar en nuestra comprensión del genoma, las vías involucradas en la patogénesis de la enfermedad, así como identificar posibles dianas terapéuticas.

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High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

Se describe una metodología que combina el cultivo de células automatizadas con alto contenido de imágenes para visualizar y cuantificar múltiples procesos celulares y de las estructuras, de un modo de alto rendimiento. Estos métodos pueden ayudar en la anotación más funcional de los genomas, así como identificar las redes de genes de enfermedades y los posibles objetivos farmacológicos.

Filtrado de contenido de alta en las enfermedades neurodegenerativas

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

17.4K vistas.  VU University Medical Center. Se describe una metodología que combina el cultivo de células automatizadas con alto contenido de imágenes para visualizar y cuantificar múltiples procesos celulares y de las estructuras, de un modo de alto rendimiento. Estos métodos pueden ayudar en la anotación más funcional de los genomas, así como identificar las redes de genes de enfermedades y los posibles objetivos farmacológicos.

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The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

El uso de fibroblastos humanos primarios para la Supervisión de fenotipos mitocondriales en el campo de la enfermedad de Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Investigación

Medicina

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

La detección de Modificadores melanoma utilizando un modelo de pez cebra Tumor autóctona

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Diffusion Tensor Magnetic Resonance Imaging in the Analysis of Neurodegenerative Diseases

Diffusion tensor imaging (DTI) techniques provide information on the microstructural processes of the cerebral white matter (WM) in vivo. The present applications are designed to investigate differences of WM involvement patterns in different brain diseases, especially neurodegenerative disorders, by use of different DTI analyses in comparison with matched controls. 	
DTI data analysis is performed in a variate fashion, i.e. voxelwise comparison of regional diffusion direction-based metrics such as fractional anisotropy (FA), together with fiber tracking (FT) accompanied by tractwise fractional anisotropy statistics (TFAS) at the group level in order to identify differences in FA along WM structures, aiming at the definition of regional patterns of WM alterations at the group level. Transformation into a stereotaxic standard space is a prerequisite for group studies and requires thorough data processing to preserve directional inter-dependencies. The present applications show optimized technical approaches for this preservation of quantitative and directional information during spatial normalization in data analyses at the group level. On this basis, FT techniques can be applied to group averaged data in order to quantify metrics information as defined by FT. Additionally, application of DTI methods, i.e. differences in FA-maps after stereotaxic alignment, in a longitudinal analysis at an individual subject basis reveal information about the progression of neurological disorders. Further quality improvement of DTI based results can be obtained during preprocessing by application of a controlled elimination of gradient directions with high noise levels.	
In summary, DTI is used to define a distinct WM pathoanatomy of different brain diseases by the combination of whole brain-based and tract-based DTI analysis.

Diffusion tensor imaging (DTI) basically serves as an MRI-based tool to identify in vivo the microstructure of the brain and pathological processes due to neurological disorders within the cerebral white matter. DTI-based analyses allow for application to brain diseases both at the group level and in single subject data.

Tensor de difusión por resonancia magnética en el análisis de las enfermedades neurodegenerativas

Diffusion tensor imaging (DTI) techniques provide information on the microstructural processes of the cerebral white matter (WM) in vivo. The present ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo MRI de 19F para el seguimiento de la célula

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in experimental models of synucleopathies. A transgenic mouse line (M83) over-expressing the human A53T &#945;S and spontaneously developing a dramatic clinical phenotype between eight and 22 months of age, characterized by symptoms including weight loss, prostration, and severe motor impairment, was used in this study. For molecular analyses of &#945;SD (disease-associated &#945;S) in these mice, an ELISA was designed to specifically quantify &#945;SD in sick mice. Analysis of the central nervous system in this mouse model showed the presence of &#945;SD mainly in the caudal brain regions and the spinal cord. There were no differences in &#945;SD distribution between different experimental conditions leading to clinical disease, i.e., in uninoculated and normally aging transgenic mice and in mice inoculated with brain extracts from sick mice. The specific detection of &#945;SD immunoreactivity using an antibody against Ser129 phosphorylated &#945;S by ELISA essentially correlated with that obtained by Western blot and immunohistochemistry. Unexpectedly, similar results were observed with several other antibodies against the C-terminal part of &#945;S. The propagation of &#945;SD, suggesting the involvement of a &#8220;prion-like&#8221; mechanism, can thus be easily monitored and quantified in this mouse model using an ELISA approach.

Detection of Disease-associated &amp;#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &amp;#945;-synuclein

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated &#945;S form or the C-terminal part of the protein.

La detección de la enfermedad asociada-α-sinucleína por ELISA mejorada en el cerebro de ratones transgénicos que sobreexpresan A53T humano mutado α-sinucleína

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &amp;#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

Un alto contenido<em&gt; In Vitro</em&gt; Islotes pancreáticos de células β plataforma de descubrimiento de replicación

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

Un alto rendimiento, multiplexado y dirigida proteómico CSF ​​ensayo para cuantificar neurodegenerativas Biomarcadores y apolipoproteína E isoformas Estado

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

Longitudinal<em&gt; En Vivo</em&gt; Obtención de imágenes de la vasculatura cerebral: Importancia de las enfermedades del sistema nervioso central

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Ensayo de eflujo de colesterol marcado con Nitrobenzoxadiazole de alto rendimiento

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

Islet autoantibodies (IAbs) are widely used in type 1 diabetes (T1D) diagnosis and prediction. Four major IAbs to insulin (IAA), glutamate decarboxylase-65 (GADA), insulinoma antigen-2 (IA-2A), and zinc transporter-8 (ZnT8A) are equally important in disease prediction. Presently, up to 40% of patients diagnosed with T1D go on to develop other autoimmune disorders. Unfortunately, current screening methods using a single autoantibody for measurement are laborious and inefficient for large scale screening studies. We recently developed a simple multiplexed electrochemiluminescence (ECL) assay to address these current issues. The assay combines all 7 autoantibody tests into one well. Each well includes three IAbs (IAA, GADA, and IA-2A), autoantibodies to thyroid peroxidase (TPOA) and thyroid globulin (ThGA) to detect autoimmune thyroid disease, autoantibodies to tissue transglutaminase (TGA) for celiac disease, and autoantibodies to interferon alpha (IFN&#945;A) for autoimmune polyglandular syndrome-1 (APS-1); all of which screen for T1D and other relevant autoimmune diseases, simultaneously. The multiplex ECL assay is based on the single ECL assay platform, but instead uses the multiplex plate combining multiple autoantibody assays, up to 10, into a single well. The main difference from the single ECL assay is that each antibody-antigen complex formed in the fluid-phase is restrained onto a specific spot on each well through a linker system on the multiplex plate. The 7-Plex ECL assay, in the present study, is validated against standard radio-binding assays (RBA) and single ECL assays, using a large cohort of newly diagnosed T1D patients and age-matched healthy controls, resulting in excellent assay sensitivity and specificity.

We model a simple multiplexed ECL assay that combines 7 autoantibody assays together. The assay is capable of screening for T1D and multiple other autoimmune diseases, simultaneously, including celiac disease, autoimmune thyroid disease, and autoimmune polyglandular syndrome 1.