Este método extiende la nanotecnología del ADN a partir de los materiales de origen del oligonucleótido lineal, DAS, a un DAS más circular. Las principales ventajas de estos técnicos son que es simple, robusto y asequible para la mayoría de los laboratorios. Para la purificación circular del ADN, añada 20 microlitros de formamida a una solución de ADN circular recién preparado e intacto, a un volumen final de 140 microlitros con mezcla.
Cargue de 16 a 20 microlitros de solución circular de ADN a cada uno de siete a nueve pozos de gel PAGE desnaturalizadores. Mezclar dos microlitros de tinte de carga con ocho microlitros del ADN lineal precursor correspondiente, e inyectar la mezcla en un pozo de referencia separado. A continuación, ejecute el gel durante unas dos horas a 10 voltios por centímetro, deteniendo la carrera cuando el xileno ciaol FF se puede observar alrededor de dos tercios por el gel.
Usando guantes y gafas de goma, transfiera el gel a una placa de cromatografía fluorescente de capa fina y use una cuchilla de afeitar para cortar las bandas de gel de destino, tal como se ve a la irradiación UV. Coloque las bandas de gel en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros para secar, luego machaque los geles secos en una pasta y agregue agua desingelada al doble del volumen de gel, para agitar durante la noche a temperatura ambiente. A la mañana siguiente, filtre la mezcla en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros, enjuagando los lados del primer tubo con un pequeño volumen de agua desinimañada para recuperar cualquier ADN residual, y filtrando de nuevo para combinar los sobrenadas.
Luego purificar el ADN circular a través de la precipitación de etanol, y almacenar el ADN en menos 20 grados Celsius. Para un recocido de maceta, mezcle dos microlitros de tampón de magnesio EDTA de acetato Tris de 10 veces, un microlitro de cada solución de material de ADN micromolar de un conjunto de hebras lineales y circulares en proporciones molares iguales, y tampón Tris EDTA adicional en un tubo de prueba PCR de 200 microlitros, a un volumen final de 20 microlitros. A continuación, recose la solución de montaje en una botella térmica de 95 a 25 grados Centígrados, durante 48 horas.
Para el recocido en dos pasos de las celosías infinitas, mezcle dos microlitros de tampón de magnesio EDTA de acetato de Tris de 10 veces, un microlitro de cada solución de material de ADN micromolar de cada 10 micromolares de un conjunto de hebras lineales y circulares en proporciones molares iguales, y un tampón Tris EDTA adicional en un tubo de ensayo PCR de 200 microlitros, a un volumen final de 20 microlitros. En el primer paso de recocido de sub-teja, recose cada solución de sub-teja precursora en un termocicloctador PCR, utilizando un método de enfriamiento lineal rápido de 95 a 25 grados Celsius, durante dos horas y media. Para preparar la solución de montaje, para cada una de las cuatro celosías infinitas, mezcle 10 microlitros de cada una de las dos soluciones de subtaja correspondientes, a una concentración final de 0,25 micromolares para cada hebra.
En el segundo paso de recocido de celosía, recocido la mezcla de 20 microlitrados en un termocicloctador PCR, utilizando un método de enfriamiento lento. Para el recocido en dos pasos de dos celosías rectangulares finitas, mezcle un microlitro de 10 pásnbús de magnesio Tris acetato EDTA, 0,5 microlitros de cada solución de 10 micromolares de ADN de un conjunto de hebras lineales y circulares en proporciones molares iguales, y un búfer Tris EDTA adicional en un tubo de ensayo PCR de 200 microlitros, a un volumen final de 10 microlitros. En el primer paso de recocido, recose cada solución precursora de subtaje en el termocicloctador PCR, utilizando el método de enfriamiento lineal rápido, como se demostró, de 95 a 25 grados Celsius, más de dos horas y media, y mezclar las soluciones de sub-baldosas recocidos 32, cada una con 2 microlitros, juntos en un tubo de prueba PCR de 200 microlitros, a un volumen final de 64 microlitros.
A continuación, en el segundo paso de recocido, recocido la mezcla de 64 microlitrotro en el termociclo, utilizando el método de enfriamiento lento, como se demostró. Para la purificación de la electroforesis de las celosías finitas, preparar un gel nativo de 2% agarosa y cargar 20 microlitros de la solución de celosía finita en cada pozo, junto con la adición de 5 microlitros de una escalera de ADN de 100 a 3000 pares de base, en un pozo separado. Después de ejecutar el gel durante dos horas a 5 voltios por centímetro en un baño de agua helada, corte las bandas de gel objetivo a aproximadamente el nivel del marcador de par base 1000 bajo luz UV, como se ha demostrado, y corte las bandas de gel en trozos finos.
Coloque los geles triturados en una columna de filtro y centrifugar la columna para extraer las celosías. A continuación, recoja la solución para la toma de imágenes por microscopía de fuerza atómica. Para la purificación de celosía finita por glicol de polietaleno, o PEG, mezcle 50 microlitros de la solución de celosía finita con un volumen igual de 15%PEG 8000 tampón, centrifugar la solución y re suspendir el pellet en 100 microlitros de tampón PEG, para una centrifugación adicional.
Después de la segunda centrifugación, vuelva a suspender el pellet en Tampón de magnesio EDTA de acetato de Tris, para la toma de imágenes de microscopía de fuerza atómica. Para obtener imágenes infinitas del microscopio de fuerza atómica de celosía 2D, corte una nueva capa de mica y deposite dos microlitros de la muestra recocido en la superficie limpia. Dejar que las celosías de ADN se absorban dos minutos hasta la superficie de la mica, antes de lavar la superficie dos veces, con 100 microlitros de agua desiniónica por lavado, secando la superficie con aire comprimido después del segundo lavado.
Para obtener imágenes de microscopio de fuerza atómica de las celosías de ADN infinitas en el aire, abra el modo de roscado en el software de imágenes y establezca el tamaño del escaneo en 0,5 a cinco micrómetros, la resolución del escaneo en 512 líneas y la velocidad de escaneo entre uno y 3,5 Hertz. A continuación, escanee la superficie de la mica con sondas triangulares de microscopio de fuerza atómica. Para imágenes de celosías de ADN finitas, corte una nueva capa de mica, como se ha demostrado, y deposite 80 microlitros de un tampón de magnesio Tris acetato de Tris en la superficie limpia de mica.
A continuación, agregue cinco microlitros de muestras finitas en el tampón, y permita que las celosías de ADN se absorban dos minutos a la superficie de la mica, antes de agregar otros 50 microlitros de tampón de magnesio EDTA de acetato de Tris a la sonda. A continuación, establezca el tamaño de escaneado en 0,5 a un micrómetro, la resolución de escaneado en 256 líneas y la velocidad de escaneo en 1,5 Hertz, antes de escanear la superficie con las sondas triangulares, como se ha demostrado. El ADN circular se mueve ligeramente más lento que su ADN lineal precursor en la PAGINA desnaturalista, porque el poro dentro del ADN circular es penetrado y retardado por las fibras de gel.
Las familias circulares de 64 conjuntos de nucleótidos tienen una sola banda clara y limpia para cada ensamblaje, lo que confirma la estabilidad de sus motivos monómeros. Las familias circulares de 84 conjuntos de nucleótidos de azulejos, sin embargo, tienen frotis alrededor de sus bandas principales, lo que indica la presencia de subproductos menores. Independientemente del menor por productos de asociados incorrectos, excelentes celosías con altos rendimientos se pueden ensamblar a partir de los motivos monómeros de destino.
Cada ensamblaje tiene sus propias características morfológicas en la escala micrómetro, como nanohilos, nanotubos, nanospirales, nanoribbons y nanorectángulos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar evitar, en particular, la contaminación de escombros durante o fuera de los escalones. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que las investigaciones en el campo de la nanotecnología del ADN exploraran nuevos miembros de la familia de una nanotecnología de ADN más circular.
