Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la deliberación de UCMSC, como la mejor fuente de USMSC para la terapia celular. La principal ventaja de esta técnica es que permite un aislamiento constante y una proliferación vigorosa de UCMSC de los bebés prematuros y a término. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de enfermedades intratables.
Aunque este método puede proporcionar información sobre la deliberación de UCMSC, también se puede aplicar a otras fuentes de MSC, como tejido adiposo, sinovium, piel, pulpa dental, y así sucesivamente. Generalmente, un individuo nuevo en este método luchará porque hay tantas variaciones en los pasos de la disección umbilical y el aislamiento de células madre mesenquimales. La demostración visual de este método es crítica, ya que estos pasos son difíciles de aprender porque hay varios puntos propensos a pasar por alto.
Para comenzar a diseccionar el cordón umbilical, primero prepare una bandeja de metal, tijeras esterilizadas y fórceps, pipetas de diez mililitros, pipetas de 25 mililitros y dos platos de cultivo de tejido de 60 milímetros. Calentar las mezclas de enzimas purificadas PBS, un 500 mililitros de medio sérico reducido y medio de cultivo, a temperatura ambiente. Retire el cordón umbilical previamente aislado de un tubo de 50 mililitros en meM alfa y colóquelo en la bandeja de plástico.
Pesar el cordón umbilical, y luego utilizar tijeras esterilizadas para diseccionar cinco gramos del cordón. Para esterilizar el cordón umbilical, utilice una pipeta de diez mililitros para verter diez mililitros de 70 por ciento de etanol sobre él. A continuación, lave el cable dos veces añadiendo diez mililitros de PBS con pipeta de diez mililitros.
Coloque el cordón umbilical lavado en el plato de cultivo de tejido esterilizado de 60 milímetros y agregue diez mililitros de medio sérico reducido y mezclas de enzimas purificadas de 0,5 mililitros. Utilice tijeras y fórceps esterilizados para cortar el cordón en piezas de dos a tres milímetros. Coloque el plato en una incubadora de dióxido de carbono del cinco por ciento e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
Luego corta las piezas parcialmente digeridas en trozos más pequeños, e incubarlas a 37 grados celsius en una incubadora de dióxido de carbono del cinco por ciento hasta que el homogeneizado se vuelva viscoso. Por último, asegúrese de que el homogeneizar fluya fácilmente a través de una pipeta de 25 mililitros. Primero prepare cuatro tubos de plástico de 50 mililitros en una botella de 500 mililitros de medio de cultivo.
Utilice una pipeta de 25 mililitros para dividir el homogeneizar del cordón umbilical en dos tubos de plástico de 50 mililitros con aproximadamente 7,5 mililitros en cada tubo. A continuación, agregue 20 mililitros de medio de cultivo en cada tubo y mezcle bien. Recoger cada homogeneizar con una pipeta de 25 mililitros y filtrar a través de un colador celular de 100 micrómetros colocado encima de un nuevo tubo de recolección de 50 mililitros.
Centrifugar dos tubos con filtrados a 1000g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de terminar la centrifugación, aspirar cuidadosamente el sobrenadante y deséchelo. Añadir cinco mililitros de medio de cultivo a cada tubo, y volver a suspender los pellets celulares.
Transfiera la suspensión celular a una nueva placa de 60 milímetros y cultivo a 37 grados celsius en una incubadora de dióxido de carbono cinco por ciento. Para cultivar los UCMSC, caliente el PBS, la trippsina EDTA y el medio de cultivo, a temperatura ambiente. Cuando las células estén unidas a la placa, retire el medio y lávelo dos veces con cinco mililitros de PBS para eliminar los desechos y los glóbulos rojos.
Añadir el medio de cultivo e incubar a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono cinco por ciento. Reemplace el medio dos veces por semana y escarúrme las células hasta que alcancen el 90 al 100 por ciento de confluencia. Luego lave las células dos veces con cinco mililitros de PBS, agregue 0,5 mililitros de trippsina EDTA e incubar a 37 grados centígrados durante cinco a diez minutos.
Cuando las células se vuelven redondeadas y desprendidas, agregue nueve mililitros de medio de cultivo, y mezcle bien para inactivar la trippsina. Agregue la suspensión celular en una nueva placa de 100 milímetros. Crecer las células a 37 grados celsius en una incubadora de dióxido de carbono cinco por ciento hasta que alcanzan el 90 al 100 por ciento de confluencia.
Repite la tripsinación y divida en dos placas nuevas, hasta el décimo pasaje. La expresión de marcador de superficie de UCMSC se utilizó como criterio para su caracterización. Cuando se incubaron con anticuerpos apropiados y se analizaron mediante citometría de flujo, se encontraron positivos para los marcadores de firma de MSC, pero negativos para los macrófagos monocitos, negativos para células madre hematapoyéticas y células efiitheliales, negativos para células B, negativos para leucocitos pan, y negativos para marcadores complejos de histocompatibilidad importantes.
Para evaluar la capacidad de diferenciación de trilines de USCMSC de bebés prematuros y a término, las células fueron inducidas a diferenciarse en adipocitos, osteocitos y condrocitos. UCMSC se diferenció con éxito en los tres tipos de células mesodérmicas que confirman su capacidad de diferenciación. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que hay cuatro pasos críticos.
Cortar el cable en trozos de dos a tres centímetros, cortar en trozos más pequeños, asegurarse de que el homogeneizar fluye fácilmente a través de una pipeta de 25 mililitros, y filtrar el homogeneizar a través de un colador celular de 100 micrómetros.
