Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na deliberação da UCMSC, como a melhor fonte de USMSC para terapia celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o isolamento consistente e a proliferação vigorosa da UCMSC a partir de bebês pré-termo e termo. As implicações dessa técnica se estendem à terapia de doenças intratáveis.
Embora este método possa fornecer uma visão sobre a deliberação da UCMSC, ele também pode ser aplicado a outras fontes do MSC, como tecido adiposo, sinodio, pele, polpa dentária, e assim por diante. Geralmente, um novo indivíduo neste método lutará porque há tanta variação nas etapas de dissecção umbilical e isolamento de células-tronco mesenquimais. A demonstração visual deste método é fundamental, pois esses passos são difíceis de aprender porque há vários pontos propensos a serem negligenciados.
Para começar a dissecar o cordão umbilical, primeiro prepare uma bandeja de metal, tesoura esterilizada e fórceps, dez pipetas mililitros, pipetas de 25 mililitros e dois pratos de cultura tecidual de 60 milímetros. Aqueça misturas de enzimas purificadas pbs, um 500 mililitro de meio soro reduzido médio e cultura média, à temperatura ambiente. Remova o cordão umbilical previamente isolado de um tubo de 50 mililitros em alfa MEM e coloque-o na bandeja de plástico.
Pese o cordão umbilical e use uma tesoura esterilizada para dissecar cinco gramas do cabo. Para esterilizar o cordão umbilical, use 10 mililitros de pipeta para despejar dez mililitros de 70% de etanol sobre ele. Em seguida, lave o cabo duas vezes adicionando dez mililitros de PBS com pipeta de dez mililitros.
Coloque o cordão umbilical lavado no prato esterilizado de cultura tecidual de 60 milímetros e adicione dez mililitros reduzidos de soro médio e 0,5 mililitros purificados misturas de enzimas. Use tesouras esterilizadas e fórceps para cortar o cordão em pedaços de dois a três milímetros. Coloque o prato em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Em seguida, corte os pedaços parcialmente digeridos em pedaços menores, e incuba-os a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% até que a homogeneidade se torne viscosa. Por fim, certifique-se de que o homogene de homogeneiza facilmente através de uma pipeta de 25 mililitros. Primeiro prepare quatro tubos de plástico de 50 mililitros em uma garrafa de 500 mililitros de cultura média.
Use uma pipeta de 25 mililitros para dividir o cordão umbilical homogeneizar em dois tubos plásticos de 50 mililitros com aproximadamente 7,5 mililitros em cada tubo. Em seguida, adicione 20 mililitros de cultura em cada tubo e misture bem. Colete cada homogene de homogeneidade com pipeta de 25 mililitros e filtro através de um filtro de célula de 100 micrômetros colocado em cima de um novo tubo de coleta de 50 mililitros.
Centrifugar dois tubos com filtrados a 1000g por cinco minutos em temperatura ambiente. Depois de terminar a centrifugação, aspire cuidadosamente o supernasce e descarte-o. Adicione cinco mililitros de cultura em cada tubo e suspenda as pelotas celulares.
Transfira a suspensão celular para uma nova placa de 60 milímetros e cultura a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. Para cultivar os UCMSC's, aquecer o PBS, o EDTA de tripla e cultura média, à temperatura ambiente. Quando as células estiverem presas à placa, remova o meio e lave duas vezes com cinco mililitros de PBS para remover detritos e glóbulos vermelhos.
Adicione o meio de cultura e incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. Substitua o meio duas vezes por semana, e cultue as células até atingirem 90 a 100% de confluência. Em seguida, lave as células duas vezes com cinco mililitros de PBS, adicione 0,5 mililitros de trippsina EDTA e incuba a 37 graus Celsius por cinco a dez minutos.
Quando as células se tornarem arredondadas e separadas, adicione nove mililitros de cultura média, e misture bem para inativar trippsina. Adicione a suspensão da célula em uma nova placa de 100 milímetros. Cresça as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% até atingirem 90 a 100% de confluência.
Repita a trippsinização e divida em duas novas placas, até a décima passagem. A expressão de marcador de superfície dos UCMSC's foi utilizada como critério para sua caracterização. Quando incubados com anticorpos apropriados e analisados por citometria de fluxo, foram encontrados positivos para marcadores de assinatura do MSC, mas negativos para macrófago monocito, negativo para célula-tronco hematapoiética e célula efitelial, negativo para célula B, negativo para leucócitos pan, e negativo para grandes marcadores complexos de histocompatibilidade.
Para avaliar a capacidade de diferenciação trilineagem dos USCMSC's de bebês prematuros e termo, as células foram induzidas a se diferenciar em adipócitos, osteocitos e condrócitos. A UCMSC se diferenciou com sucesso em todos os três tipos de células mesodérmicas confirmando sua capacidade de diferenciação. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que existem quatro passos críticos.
Cortando o cabo em pedaços de dois a três centímetros, cortando em pedaços menores, certificando-se de que o homogeneato flui facilmente através de uma pipeta de 25 mililitros, e filtrando o homogeneizar através de um filtro celular de 100 micrômetros.
