שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בדיון של UCMSC, כגון המקור הטוב ביותר של USMSC לטיפול בתאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת בידוד עקבי והתפשטות נמרצת של UCMSC מתינוקות טרום טווח ומונחים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לכיוון טיפול במחלות עקשניות.
למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך הדיון של UCMSC, זה יכול להיות מיושם גם על מקורות MSC אחרים, כגון רקמת שומן, סינוביום, עור, עיסת שיניים, וכן הלאה. בדרך כלל, אדם חדש בשיטה זו יתקשה כי יש כל כך הרבה וריאציה בשלבים של ניתוח טבור ובידוד תאי גזע mesenchymal. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו שלבים אלה קשה ללמוד כי יש כמה נקודות נוטה להתעלם.
כדי להתחיל לנתח את חבל הטבור, הכינו תחילה מגש מתכת, מספריים מעוקרים ומדפים, עשרה פיפלטות מיליליטר, פיפלטות 25 מיליליטר ושתי מנות תרביית רקמה 60 מ"מ. מחממים תערובות אנזימים מטוהרות PBS, 500 מיליליטר של מדיום בינוני ותרבותי מופחת בסרום, לטמפרטורת החדר. הסר חבל טבור מבודד בעבר מצינור 50 מיליליטר ב- ALPHA MEM, והצב אותו במגש הפלסטיק.
לשקול את חבל הטבור, ולאחר מכן להשתמש במספריים מעוקל לנתח חמישה גרם של חבל הטבור. כדי לעקר את חבל הטבור, השתמש פיפטי עשרה מיליליטר לשפוך עשרה מיליליטר של 70 אחוז אתנול על זה. לאחר מכן לשטוף את החוט פעמיים על ידי הוספת עשרה מיליליטר של PBS עם פיפיטר עשרה מיליליטר.
מניחים את חבל הטבור שטוף בצלחת תרבית רקמת 60 מילימטר מעוקרת ומוסיפים עשרה מיליליטר מופחת סרום בינוני ו 0.5 מיליליטר תערובות אנזים מטוהרים. השתמש במספריים מעוקרים ומדפים כדי לחתוך את החוט לחתיכות של שניים עד שלושה מילימטרים. מניחים את המנה בממרח פחמן דו חמצני חמישה אחוזים וחממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
לאחר מכן חותכים את החלקים המתעכלים חלקית לחתיכות קטנות יותר, ודגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5 אחוז פחמן דו חמצני עד הומוגני הופך צמיג. לבסוף, ודא כי הומוגנית זורם בקלות דרך פיפטה 25 מיליליטר. ראשית להכין ארבעה, 50 צינורות פלסטיק מיליליטר בבקבוק 500 מיליליטר של מדיום תרבות.
השתמש פיפטה 25 מיליליטר כדי לחלק את חוט הטבור homogenate לשתיים, 50 צינורות פלסטיק מיליליטר עם כ 7.5 מיליליטר בכל צינור. לאחר מכן מוסיפים 20 מיליליטר של מדיום תרבות לתוך כל צינור ומערבבים היטב. לאסוף כל הומוגנט עם פיפט 25 מיליליטר ולסנן דרך מסננת תא 100 מיקרומטר להציב על גבי צינור אוסף חדש 50 מיליליטר.
צנטריפוגה שני צינורות עם filtrates ב 1000g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה גמורה, בזהירות שאף את העל-טבעי והשליך אותו. מוסיפים חמישה מיליליטר של מדיום תרבות לכל צינור, ולהשעות מחדש את כדורי התא.
העבר את ההשעיה התא לתוך צלחת חדשה 60 מילימטר ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה 5 אחוז פחמן דו חמצני. כדי לתרבת את UCMSC של, לחמם את PBS, טריפסין EDTA, ותרבות בינונית, לטמפרטורת החדר. כאשר תאים מחוברים לצלחת, להסיר את המדיום, ולשטוף פעמיים עם חמישה מיליליטר של PBS כדי להסיר פסולת ותאי דם אדומים.
מוסיפים את מדיום התרבות ואת האינקובט ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של חמישה אחוזים פחמן דו חמצני. החלף את המדיום פעמיים בשבוע, ותרבת את התאים עד שהם מגיעים 90 עד 100 אחוז confluency. לאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם חמישה מיליליטר של PBS, להוסיף 0.5 מיליליטר של טריפסין EDTA, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש עד עשר דקות.
כאשר התאים הופכים מעוגלים ומנותקים, מוסיפים תשעה מיליליטר של מדיום תרבותי, ומערבבים היטב כדי להשבית טריפסין. מוסיפים את מתלי התא לצלחת חדשה של 100 מ"מ. לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב5 אחוז פחמן דו חמצני אינקובטור עד שהם מגיעים 90 עד 100 אחוז confluency.
חזור על טריפסיניזציה וחלוקה לשתי צלחות חדשות, עד הקטע העשירי. ביטוי סמן פני השטח של UCMSC's שימש כקריטריון לאפיון שלהם. כאשר הם דגירה עם נוגדנים מתאימים ונותחו על ידי ציטומטריית זרימה, הם נמצאו חיוביים עבור סמני החתימה של MSC, אבל שלילי עבור מקרופאג מונוציטים, שלילי עבור תא גזע hematapoietic ותא אפיתל, שלילי עבור תא B, שלילי עבור לויקוציטים פאן, ושלילי עבור סמנים מורכבים היסטו-תאימות העיקריים.
כדי להעריך את יכולת ההבחנה של מיון של USCMSC מפגים ומונח תינוקות, התאים היו המושרים כדי להבדיל לתוך adipocytes, osteocytes, ו chondrocytes. UCMSC של הבדיל בהצלחה לכל שלושת הסוגים של תאים mesodermal המאשר את יכולת ההבחנה שלהם. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי ישנם ארבעה שלבים קריטיים.
חותכים את החוט לחתיכות של שניים עד שלושה סנטימטרים, חותכים לחתיכות קטנות יותר, מוודאים שההומוגנטי זורם בקלות דרך פיפטה של 25 מיליליטר, ומסננים את ההומוגנט דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר.
