이 방법은 세포 치료를 위한 USMSC의 최고 근원과 같은 UCMSC의 심의에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 사전 및 기간 유아에서 UCMSC의 일관된 격리 및 활발한 확산을 가능하게한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 난치성 질병의 치료로 확장됩니다.
이 방법은 UCMSC의 심의에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 지방 조직, 시노비움, 피부, 치과 펄프 등과 같은 다른 MSC 소스에 적용 될 수있다. 일반적으로, 이 방법에 새로 온 개별은 탯줄 및 중간엽 줄기 세포 격리의 단계에 너무 많은 변이가 있기 때문에 투쟁할 것입니다. 이러한 단계를 간과하기 쉬운 몇 가지 사항이 있기 때문에 이 방법의 시각적 데모는 매우 중요합니다.
탯줄을 해부하기 시작하려면 먼저 금속 트레이, 멸균 가위 및 집게, 10 밀리리터 파이펫, 25 밀리리터 파이펫 및 2개의 60mm 조직 배양 접시를 준비하십시오. PBS 정제 효소 블렌드를 데우면, 500밀리리터의 혈청 배지 및 배양 배지를 실온으로 데워보실 수 있습니다. 알파 MEM의 50 밀리리터 튜브에서 이전에 분리된 탯줄을 제거하고 플라스틱 트레이에 놓습니다.
탯줄을 계량한 다음 멸균 된 가위를 사용하여 5 그램의 코드를 해부합니다. 탯줄을 살균하려면 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 70 %의 에탄올 10 밀리리터를 부어 넣습니다. 그런 다음 10 밀리리터 파이펫으로 PBS1밀리리터를 추가하여 코드를 두 번 씻으십시오.
세척된 탯줄을 멸균 60mm 조직 배양 접시에 넣고 10밀리리터감소세럼 배지와 0.5 밀리리터 정제 효소 블렌드를 추가합니다. 멸균 된 가위와 집게를 사용하여 코드를 2 ~ 3 밀리미터 조각으로 자른다. 이 요리를 이산화탄소 인큐베이터5%에 놓고 30분간 섭씨 37도에 배양합니다.
그런 다음 부분적으로 소화된 조각을 작은 조각으로 자르고, 동형이 점성이 될 때까지 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양합니다. 마지막으로, 균동형이 25 밀리리터 파이펫을 통해 쉽게 흐르는지 확인하십시오. 먼저 배양 배지 의 500 밀리리터 병에 4, 50 밀리리터 플라스틱 튜브를 준비합니다.
25 밀리리터 파이펫을 사용하여 탯줄 균모네이트를 각 튜브에 약 7.5 밀리리터가 있는 2, 50 밀리리터 플라스틱 튜브로 나눕니다. 그런 다음 각 튜브에 20 밀리리터의 배양 배지를 넣고 잘 섞습니다. 25 밀리리터 파이펫으로 각 호모를 수집하고 새로운 50 밀리리터 수집 튜브 위에 배치 된 100 마이크로 미터 세포 스트레이너를 통해 필터.
원심분리기 는 실온에서 5 분 동안 1000g의 여과가있는 두 개의 튜브. 원심 분리를 마친 후, 상체를 조심스럽게 흡인하고 폐기하십시오. 각 튜브에 배양 배지의 5 밀리리터를 추가하고 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
세포 현탁액을 새로운 60mm 플레이트로 옮기고 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양합니다. UCMSC의 문화, PBS를 따뜻하게, 트립신 EDTA, 및 문화 매체, 실온에. 세포가 접시에 부착되면, 매체를 제거하고, 이물질과 적혈구를 제거하기 위해 PBS의 다섯 밀리리터로 두 번 세척.
배양 배지를 추가하고 이산화탄소 인큐베이터의 경우 섭씨 37도에 배양합니다. 매질을 일주일에 두 번 교체하고 90~100% 합류에 도달할 때까지 세포를 배양합니다. 그런 다음 PBS의 5 밀리리터로 세포를 두 번 씻고 트립신 EDTA의 0.5 밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 5~10분 동안 배양합니다.
세포가 둥글게 되고 분리될 때, 배양 배지의 9밀리리터를 추가하고 잘 섞어서 트립신을 비활성화합니다. 셀 서스펜션을 새로운 100mm 플레이트에 추가합니다. 90~100% 합류에 도달할 때까지 이산화탄소 인큐베이터의 경우 섭씨 37도에서 세포를 성장시보겠습니다.
10번째 구절까지 트립시화와 두 개의 새 판으로 나누어 반복합니다. UCMSC의 표면 마커 발현은 특성화에 대한 기준으로 사용되었습니다. 적절한 항체로 배양하고 유동 세포측정에 의해 분석될 때, 그들은 MSC의 서명 마커에 대해 양성 반응을 보였지만, 단세포 대식세포에 대한 부정적, 혈액 세포 및 피세포에 대한 부정적, B 세포에 대한 부정적, 판 백혈구에 대한 부정적, 주요 조직비호환성 복합 마커에 대한 부정적.
PRETERM 및 기간 유아로부터 USCMSC의 삼중 분화 능력을 평가하기 위해 세포는 지방세포, 골세포 및 연골세포로 분화하도록 유도되었다. UCMSC는 성공적으로 그들의 분화 능력을 확인하는 중피 세포의 3가지 모형으로 분화했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 네 가지 중요한 단계가 있음을 기억하는 것이 중요합니다.
코드를 2~3센티미터 로 자르고 작은 조각으로 자르고, 25밀리리터 파이펫을 통해 호모게네이트가 쉽게 흐르도록 하고, 100마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 동형체를 필터링합니다.
