Este protocolo es el primero en introducir la tecnología de escaneo 3D en el campo de la investigación anatómica, específicamente neuroanatómica, y ha logrado un rendimiento superpuesto altamente preciso. La superposición de incrustación de neuro 3D, o protocolo neuro 3D, incorpora tomas estériles a microescala en imágenes cerebrales a escala macro y une estas diferentes escalas espaciales sin problemas. También tenemos que aplicar el protocolo neuro 3D a las resonancias magnéticas humanas y al cerebro post mortem.
La superposición nos permite identificar patrones de contraste de RESONANCIA magnética conocidos relacionados con la enfermedad. Los sistemas de escaneo 3D son sensibles al agua que rodea el biomofijo extraído, por lo que es fundamental limpiar el agua con mucho cuidado. Además, el procedimiento debe realizarse lo antes posible.
Comience este procedimiento con la preparación de un ratón, así como adquisiciones de RMN y preparaciones de equipos como se describe en el protocolo de texto. En el segundo día, corta el cuero cabelludo de un ratón previamente eutanasiado a lo largo de la sutura sagital usando tijeras quirúrgicas. Usa tijeras quirúrgicas para cortar el cráneo en direcciones diagonales desde el punto de lambda hasta un punto un poco delante del bregma.
Luego, despegue suavemente el cráneo del cerebro usando pinzas curvas. Levante el cerebro con una espátula y transfiéralo a un plato de Petri con una solución de corte en frío. Usando una bomba de gas externa con una velocidad de bomba giratoria controlada, el aire de flujo que contiene 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono para generar pequeñas burbujas en la solución de corte en frío.
Después de uno a dos minutos, coloque el cerebro sobre un paño de microfibra cuya superficie está ligeramente cubierta por un tamiz de harina. Limpie suavemente el líquido de la superficie cerebral con el paño de microfibra. Coloque el cerebro, con su aspecto dorsal hacia arriba, en el soporte de la muestra.
A continuación, coloque el soporte de muestra en el centro del plato giratorio automático. Oscurezca la habitación durante el escaneo 3D y realice un escaneo 3D en el plato giratorio. Para comprobar si el escaneo 3D funciona bien, haga clic en Escaneo 3D seleccionando el ángulo entre dos tomas como 22.5, el ángulo inicial como cero y el ángulo final como 360.
Mueva el cerebro a una placa de Petri y burbujee el cerebro en la solución de corte durante aproximadamente 10 segundos. Corta el cerebro en dos bloques en el centro del plano coronal, usando un bisturí. Luego, mueva los dos bloqueos cerebrales suavemente a la superficie plana usando una espátula quirúrgica.
Adjunte los bloqueos cerebrales de la base del bloqueo cerebral usando pegamento instantáneo. Limpie suavemente y cuidadosamente el líquido de la superficie cerebral en uno o dos minutos, utilizando el paño de microfibra. A continuación, vuelva a realizar una exploración 3D.
Coloque una cuchilla en el soporte de la cuchilla del vibratomo. Coloque la cinta negra que cubre el centro de la base del bloque cerebral al centro de la etapa de corte para un vibratome. Vierta la solución de corte en la etapa de corte y ponga la etapa de corte en el vibratome.
Ajuste la velocidad de corte y la amplitud. Haz de dos a cinco rebanadas coronales de 300 micras de espesor de los dos bloques cerebrales. Mantenga la solución en la etapa de corte burbujeando si es posible.
Optimice la velocidad de corte, la frecuencia y la amplitud de vibración del sistema estableciéndolos como 12,7 milímetros por minuto para la velocidad, de 87 a 88 hercios para la frecuencia y de 0,8 a 1,0 milímetros para la anchura de oscilación. Al cortar las rebanadas cerebrales, registre la coordenada segmentada en el formato, incluida la coordenada anterior posterior, el hemisferio y otras condiciones. Transfiera suavemente las rodajas cerebrales a un vaso de precipitados lleno de ACSF precalegado usando una pipeta de plástico gruesa.
Incubar las rebanadas cerebrales en el vaso de precipitados a aproximadamente 34 grados centígrados durante una hora. Durante este tiempo, realice una exploración 3D de los bloqueos cerebrales restantes en la etapa de corte. Ahora, establezca una matriz multielectroda, o chip MEA, en una unidad de grabación.
Conecte el chip a una bomba peristáltica utilizando dos tubos. Utilice un tubo para guiar el mismo ACSF en el chip MEA y el otro tubo para guiar el ACSF fuera del chip MEA. Coloque dos agujas, conectadas en las puntas de los dos tubos, a la parte superior de la pared del chip MEA.
Fije sus posiciones con sus puntas siguiendo la pared interior del chip MEA. Establezca el caudal del ACSF en 4,1 RPM. Realice el procesamiento de datos de RMN para extraer volúmenes corticales como se describe en el protocolo de texto.
Para realizar el procesamiento de imágenes de RMN, descargue el software gratuito 3D Slicer. Abra las imágenes MR de los cerebros extraídos que se produjeron utilizando los módulos de representación de volumen y editor en la segmentación 3D. Cambie el modo de editor a renderizado de volumen y haga clic en un botón de destino para que la imagen del cerebro llegue al centro de la pantalla.
Seleccione el modo cerebral MRT-2 y ajuste los umbrales moviendo la barra de desplazamiento. A continuación, vuelva de la representación de volumen al editor y haga clic en el botón de efecto de umbral. Aplicar la etiqueta 41, corteza cerebral.
A continuación, guarde los datos de la superficie del cerebro como un archivo STL cambiando el formato de archivo de VTK a STL en la lista de comprobación de formulario. Realice una ordenación automática entre ocho o 16 imágenes tomadas de ocho o 16 ángulos diferentes dentro de una secuencia de un escaneo para corregir pequeñas discrepancias. Para ello, haga clic en Registro global incluido en la opción de alineación e integre las imágenes.
Repita las exploraciones desde diferentes ángulos para obtener toda la superficie cerebral. Si la integración entre imágenes escaneadas desde diferentes ángulos no se realizó correctamente, haga clic en Alineación manual y seleccione un par de imágenes fijas y una imagen en movimiento. Inicie la alineación manual de las imágenes seleccionando tres o cuatro puntos comunes en imágenes diferentes.
A continuación, haga clic en Aceptar. El algoritmo de optimización es el algoritmo iterativo de punto más cercano y no incluye una deformación no lineal. Haga una malla de todas las imágenes alineadas seleccionando todas las imágenes y haciendo clic en el botón de generación de malla. A continuación, seleccione la opción, pequeño objeto artístico, para obtener la malla en la resolución más alta.
Guarde la imagen como STL Binary o como formato ASCII. Ahora, abra la superficie de RMN y combínelo con la superficie de escaneo 3D utilizando el software de procesamiento de superficies. Realice un proceso de alineación manual como antes.
A continuación, guarde estas imágenes de superficie coregistradas de nuevo. Si es necesario, limpie los datos de la superficie individual borrando pequeños ruidos que rodean la región cerebral, especialmente en el caso de los datos de RMN, y rellenando cualquier agujero, especialmente en el caso de los datos de escaneo 3D. Por último, abra los datos de superficie con software de análisis de datos como MATLAB.
Genere y evalúe los histogramas de las distancias mínimas entre las dos superficies. Las distancias se evaluaron entre superficies corticales producidas por la eliminación del volumen de RMN y las superficies obtenidas de las exploraciones 3D de cerebros extraídos. Los valores de modo del histograma de las distancias son solo 55 micras.
Además, al acumular el histograma desde el punto donde la distancia es igual a cero, el valor acumulado alcanza el 90% de los números de muestra totales a aproximadamente 300 micras. El histograma final de las distancias entre dos superficies mostró un pico típico de alrededor de 50 micras. Desde un punto de vista macroscópico, este valor de modo corresponde a la limitación geométrica, que era de 100 micras del tamaño de vóxel de las resonancias magnéticas.
Este punto sugiere indirectamente que el algoritmo superpuesto entre la resonancia magnética y el escaneo 3D funcionó muy bien, y que los niveles de ruido de la resonancia magnética y el escaneo 3D se suprimieron como un valor bajo. Este protocolo es el primero en subir a través de la tecnología de escaneo al bioorganismo. La tecnología se utilizó originalmente para las demandas puramente de ingeniería.
Aplicar esta tecnología a la medicina puede responder a nuevas preguntas. Después de la exploración 3D, podemos utilizar grabaciones de gramos de parches de pared de imágenes de calcio para obtener conocimientos complementarios en términos de resolución temporal y espacial y número de células grabables. El rendimiento superpuesto de alta precisión que proporciona este protocolo hará que una asociación perfecta entre la escala espacial anatómica y la escala espacial cero sea más realista que antes.
