このプロトコルは、解剖学的、特に神経解剖学的研究分野で3Dスキャン技術を導入する最初のものであり、非常に正確な重複性能を達成しています。3D神経埋め込みオーバーラップ、または3D神経プロトコルは、マクロスケールの脳画像にマイクロスケールの無菌ソケットを埋め込み、これらの異なる空間スケールをシームレスに橋渡しします。また、3D神経プロトコルをヒトMRIと死後の脳に適用する必要があります。
重複により、疾患に関連する既知のMRIコントラストパターンを同定することができます。3Dスキャンシステムは、抽出された生物を取り巻く水に敏感であるため、非常に慎重に水を拭く必要があります。さらに、手順はできるだけ迅速に実行する必要があります。
この手順は、テキスト プロトコルで説明されているように、マウスの準備、および MRI 取得および装置の準備から始めます。2日目には、手術用ハサミを使用して、以前に安楽死させたマウスの頭皮を矢状縫合糸に沿って切断します。手術用はさみを使用して、ラムダポイントからブレグマの少し前のポイントまで斜め方向に頭蓋骨を切断します。
その後、湾曲したピンセットを使用して脳から頭蓋骨を静かに剥がします。へらで脳を持ち上げ、氷冷切断溶液でペトリ皿に移します。制御された回転ポンプ速度を持つ外部ガス爆弾を使用して、95%の酸素と5%の二酸化炭素を含む空気を流し、氷冷切断液に小さな気泡を生成する。
1〜2分後、表面が小麦粉ふるいでわずかに覆われているマイクロファイバーの布の上に脳を置きます。マイクロファイバーの布を使用して、脳表面から静かに流体を拭きます。脳を下方面に置いて、サンプルスタンドに置きます。
次に、サンプルスタンドを自動ターンテーブルの中央に置きます。3D スキャン中に部屋を暗くし、ターンテーブルで 3D スキャンを実行します。3D スキャンが正常に動作するかどうかをテストするには、2 つのショット間の角度を 22.5、開始角度を 0、最終角度を 360 として選択して、[3D スキャン] をクリックします。
脳をペトリ皿に移動し、約10秒間切断溶液中の脳を泡立てる。メスを使用して、コロナ平面の真ん中で脳を2つのブロックにカットします。次に、外科用ヘラを使用して、2つの脳ブロックを平らな表面にそっと移動させます。
インスタント接着剤を使用して脳ブロックベースの脳ブロックを取り付けます。マイクロファイバークロスを使用して、1〜2分以内に脳表面から液を柔らかく慎重に拭きます。次に、3D スキャンを再度実行します。
ビブラートメのブレードホルダーにブレードを取り付けます。脳ブロックベースの中心を覆う黒いテープを、ビブラートメの切断ステージの中央に取り付けます。切断段階に切削液を注ぎ、ビブラートメに切削ステージを設定します。
切削速度と振幅を調整します。2つの脳ブロックから厚い300ミクロンの2〜5個のコロナスライスを作ります。可能であれば、切断段階のバブリングにソリューションを保管してください。
速度に対して 1 分あたり 12.7 ミリメートル、周波数に 87 ~ 88 ヘルツ、スイング幅に 0.8 ~ 1.0 ミリメートルを設定して、システムの切削速度、周波数、振動振幅を最適化します。脳のスライスを切断しながら、前部後方座標、半球、その他の条件を含む形式でスライスされた座標を記録します。厚いプラスチックピペットを使用して、脳スライスを事前に温めたACSFで満たされたビーカーにそっと移します。
ビーカーの脳スライスを摂氏約34度で1時間インキュベートします。この間、切断段階で残りの脳ブロックの3Dスキャンを行います。次に、記録ユニットに多電極アレイ(MEAチップ)をセットします。
2つのチューブを使用して、チップを蠕動ポンプに接続します。1 つのチューブを使用して同じ ACSF を MEA チップに誘導し、もう 1 つのチューブを使用して、ACSF を MEA チップから取り出します。2本のチューブの先端に接続された2本の針をMEAチップの壁の上部に取り付けます。
MEAチップの内壁に続くヒントでポジションを固定します。ACSF の流量を 4.1 RPM に設定します。テキストプロトコルで説明されているように、MRIデータ処理を実行して皮質ボリュームを抽出します。
MRI画像処理を実行するには、3Dスライサーフリーソフトウェアをダウンロードしてください。3D スライサーのボリューム レンダリングとエディター モジュールを使用して生成された抽出された脳の MR イメージを開きます。モードをエディタからボリュームレンダリングに変更し、ターゲットボタンをクリックして、脳の画像を画面の中央に表示します。
MRT-2脳モードを選択し、シフトバーを移動してしきい値を調整します。次に、ボリューム レンダリングからエディタに戻り、しきい値効果ボタンをクリックします。標識41、大脳皮質を適用する。
次に、フォームチェックリストで VTK から STL にファイル形式を変更して、脳表面データを STL ファイルとして保存します。スキャンのシーケンス内で 8 または 16 の異なる角度から撮影した 8 つまたは 16 の画像間で自動共登録を実行して、小さな不一致を修正します。これを行うには、配置オプションに含まれるグローバル登録をクリックし、画像を統合します。
異なる角度からスキャンを繰り返して、脳表面全体を得ます。異なる角度からスキャンした画像間の統合が失敗した場合は、「手動配置」をクリックして、固定画像と動画のペアを選択します。異なる画像の 3 つまたは 4 つの共通点を選択して、イメージの手動配置を開始します。
次に、[OK] をクリックします。最適化アルゴリズムは、反復的な最も近い点アルゴリズムであり、非線形変形は含まれません。すべてのイメージを選択し、メッシュ生成ボタンをクリックして、整列したイメージをすべてメッシュにします。次に、小さな芸術オブジェクトを選択して、メッシュを最高の解像度で取得します。
イメージを STL バイナリまたは ASCII 形式で保存します。MRI サーフェスを開き、サーフェス処理ソフトウェアを使用して 3D スキャン サーフェスとマージします。以前と同様に手動で調整を行います。
次に、これらの登録されたサーフェス イメージを再度保存します。必要に応じて、特にMRIデータの場合は、脳領域を取り巻く小さなノイズを消去し、特に3Dスキャンデータの場合は穴を埋めることによって、個々の表面データを清掃します。最後に、MATLABなどのデータ解析ソフトウェアでサーフェスデータを開きます。
2 つのサーフェス間の最小距離のヒストグラムを生成し、評価します。MRI体積を除去して生成した皮質表面と、抽出された脳の3Dスキャンから得られた表面間の距離を評価した。距離のヒストグラムのモード値はわずか55ミクロンです。
また、距離がゼロの地点からヒストグラムを蓄積すると、累積値は約300ミクロンでサンプル総数の90%に達します。2つの表面間の距離の最終的なヒストグラムは、約50ミクロンの典型的なピークを示した。このモード値は、マクロ的な観点から、MRIのボクセルサイズから100ミクロンであった幾何学的な制限に対応しています。
この点は、MRIと3Dスキャンの間の重複するアルゴリズムが非常にうまく機能し、MRIと3Dスキャンの両方のノイズレベルが低い値として抑制されたことを間接的に示唆しています。このプロトコルは、バイオ生物にスキャン技術を通じて上昇する最初のプロトコルです。この技術はもともと純粋にエンジニアリングの要求に利用されていました。
この技術を医学に応用することは、新しい疑問に答えることができます。3Dスキャンの後、カルシウムイメージングウォールパッチグラム記録を使用して、時間的および容量分解能と記録可能な細胞数の観点から補完的な知識を得ることができます。このプロトコルが提供する非常に正確な重複する性能は、解剖学的空間スケールとゼロ空間スケールのシームレスな関連付けを以前よりも現実的にします。
