Dieses Protokoll ist das erste, das 3D-Scanning-Technologie im anatomischen, speziell neuroanatomischen Forschungsbereich einführt und eine hochpräzise Überlappungsleistung erzielt hat. Die 3D-Neuro-Einbettungsüberlappung oder das 3D-Neuroprotokoll bettet sterile Mikrosteckdosen in Makro-Skala-Gehirnbilder ein und überbrückt diese verschiedenen räumlichen Skalen nahtlos. Wir müssen auch das 3D-Neuroprotokoll auf menschliche MRTs und post-mortem Gehirn anwenden.
Die Überlappung ermöglicht es uns, bekannte MRT-Kontrastmuster im Zusammenhang mit Krankheiten zu identifizieren. 3D-Scansysteme reagieren empfindlich auf Wasser, das den extrahierten Bioorganismus umgibt, daher ist es wichtig, das Wasser sehr sorgfältig abzuwischen. Darüber hinaus muss das Verfahren so schnell wie möglich durchgeführt werden.
Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung einer Maus sowie MRT-Erfassungen und Gerätevorbereitungen, wie im Textprotokoll beschrieben. Schneiden Sie am zweiten Tag die Kopfhaut einer zuvor eingeschläferten Maus entlang der sagittalen Naht mit einer chirurgischen Schere. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um den Schädel in diagonale Richtungen vom Lambda-Punkt bis zu einem Punkt ein wenig vor dem Bregma zu schneiden.
Dann schälen Sie den Schädel vorsichtig aus dem Gehirn mit gekrümmten Pinzette. Heben Sie das Gehirn mit einem Spachtel an und übertragen Sie es auf eine Petrischale mit eiskalter Schneidlösung. Mit einer externen Gasbombe mit einer kontrollierten drehbaren Pumpengeschwindigkeit, Strömungsluft mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid, um kleine Blasen in der eiskalten Schneidlösung zu erzeugen.
Nach ein bis zwei Minuten das Gehirn auf ein Mikrofasertuch legen, dessen Oberfläche leicht mit einem Mehlsieb bedeckt ist. Wischen Sie die Flüssigkeit vorsichtig mit dem Mikrofasertuch von der Hirnoberfläche ab. Setzen Sie das Gehirn mit seinem dorsalen Aspekt auf den Probenständer.
Platzieren Sie dann den Probenständer in der Mitte des automatischen Drehtellers. Verdunkeln Sie den Raum während des 3D-Scans und führen Sie einen 3D-Scan auf dem Plattenspieler durch. Um zu testen, ob der 3D-Scan gut funktioniert, klicken Sie auf 3D-Scan, indem Sie den Winkel zwischen zwei Aufnahmen als 22,5, den Startwinkel als Null und den letzten Winkel als 360 auswählen.
Bewegen Sie das Gehirn zu einer Petrischale und blasen Sie das Gehirn in der Schneidlösung für etwa 10 Sekunden. Schneiden Sie das Gehirn in zwei Blöcke in der Mitte der koronalen Ebene, mit einem Skalpell. Dann bewegen Sie die beiden Gehirnblöcke sanft auf die flache Oberfläche mit einem chirurgischen Spachtel.
Befestigen Sie die Gehirnblöcke der Gehirnblockbasis mit Instantkleber. Wischen Sie die Flüssigkeit mit dem Mikrofasertuch innerhalb von ein bis zwei Minuten vorsichtig von der Hirnoberfläche ab. Führen Sie dann erneut einen 3D-Scan durch.
Befestigen Sie eine Klinge am Klingenhalter des Vibratom. Befestigen Sie das schwarze Band, das die Mitte der Gehirnblockbasis bedeckt, an der Mitte der Schnittstufe für ein Vibratome. Schneidlösung in die Schneidstufe gießen und die Schnittstufe auf das Vibratome stellen.
Passen Sie die Schnittgeschwindigkeit und Amplitude an. Machen Sie zwei bis fünf koronale Scheiben von 300 Mikrometern dick aus den beiden Gehirnblöcken. Halten Sie die Lösung in der Schneidebühne sprudeln, wenn möglich.
Optimieren Sie die Schnittgeschwindigkeit, Frequenz und Schwingungsamplitude des Systems, indem Sie sie auf 12,7 Millimeter pro Minute für die Geschwindigkeit, 87 bis 88 Hertz für die Frequenz und 0,8 bis 1,0 Millimeter für die Schwingbreite einstellen. Zeichnen Sie beim Schneiden der Gehirnscheiben die geschnittene Koordinate im Format auf, einschließlich der vorderen hinteren Koordinate, der Halbkugel und anderer Bedingungen. Übertragen Sie die Gehirnscheiben vorsichtig auf einen Becher, der mit vorgewärmten ACSF gefüllt ist, mit einer dicken Kunststoffpipette.
Inkubieren Sie das Gehirn Scheiben in den Becher bei etwa 34 Grad Celsius für eine Stunde. Führen Sie während dieser Zeit einen 3D-Scan der verbleibenden Gehirnblöcke auf der Schnittstufe durch. Stellen Sie nun ein Multielektroden-Array oder einen MEA-Chip auf einer Aufnahmeeinheit ein.
Schließen Sie den Chip mit zwei Rohren an eine peristaltische Pumpe an. Verwenden Sie ein Rohr, um den gleichen ACSF in den MEA-Chip zu führen, und das andere Rohr, um den ACSF aus dem MEA-Chip zu führen. Befestigen Sie zwei Nadeln, die an den Spitzen der beiden Rohre verbunden sind, an der Oberseite der Wand des MEA-Chips.
Fixieren Sie ihre Positionen mit ihren Spitzen nach der Innenwand des MEA-Chips. Legen Sie den Durchfluss des ACSF auf 4,1 RPM fest. Führen Sie die MRT-Datenverarbeitung durch, um kortikale Volumina zu extrahieren, wie im Textprotokoll beschrieben.
Um die MRT-Bildverarbeitung durchzuführen, laden Sie die kostenlose 3D Slicer-Software herunter. Öffnen Sie die MR-Bilder der extrahierten Gehirne, die mit den Volume-Rendering- und Editor-Modulen im 3D-Slicer erzeugt wurden. Ändern Sie den Modus vom Editor zum Lautstärke-Rendering, und klicken Sie auf eine Zielschaltfläche, damit das Bild des Gehirns in die Mitte des Bildschirms kommt.
Wählen Sie den MRT-2-Gehirnmodus aus und stimmen Sie die Schwellenwerte ab, indem Sie die Schaltleiste bewegen. Wechseln Sie dann zurück vom Lautstärke-Rendering zum Editor, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Schwellenwerteffekt". Tragen Sie das Etikett 41, Großhirnrinde auf.
Speichern Sie dann die Daten der Gehirnoberfläche als STL-Datei, indem Sie das Dateiformat in der Formular-Checkliste von VTK in STL ändern. Führen Sie eine automatische Koregistrierung zwischen acht oder 16 Bildern aus acht oder 16 verschiedenen Winkeln innerhalb einer Sequenz eines Scans durch, um kleine Nichtübereinstimmungen zu korrigieren. Klicken Sie dazu auf Globale Registrierung, die in der Ausrichtungsoption enthalten ist, und integrieren Sie die Bilder.
Wiederholen Sie Scans aus verschiedenen Winkeln, um die gesamte Gehirnoberfläche zu erhalten. Wenn die Integration zwischen Bildern, die aus verschiedenen Winkeln gescannt wurden, nicht erfolgreich war, klicken Sie auf Manuelle Ausrichtung, und wählen Sie ein Paar festes Bild und ein bewegtes Bild aus. Starten Sie die manuelle Ausrichtung der Bilder, indem Sie drei oder vier gemeinsame Punkte in verschiedenen Bildern auswählen.
Klicken Sie dann auf OK. Der Optimierungsalgorithmus ist der iterative Engpunktalgorithmus und enthält keine nichtlineare Verformung. Erstellen Sie ein Netz aller ausgerichteten Bilder, indem Sie alle Bilder auswählen und auf die Schaltfläche "Netzgenerierung" klicken. Wählen Sie dann die Option, kleines künstlerisches Objekt, um das Netz mit der höchsten Auflösung zu erhalten.
Speichern Sie das Bild als STL Binary oder asCII-Format. Öffnen Sie nun die MRT-Oberfläche und verschmelzen Sie sie mit der 3D-Scanoberfläche mit der Oberflächenverarbeitungssoftware. Führen Sie wie zuvor einen manuellen Ausrichtungsprozess durch.
Speichern Sie dann diese mitregistrierten Oberflächenbilder erneut. Reinigen Sie bei Bedarf die einzelnen Oberflächendaten, indem Sie kleine Geräusche rund um den Hirnbereich, insbesondere bei den MRT-Daten, löschen und löcherfüllen, insbesondere bei den 3D-Scandaten. Öffnen Sie schließlich die Oberflächendaten mit Datenanalysesoftware wie MATLAB.
Generieren und bewerten Sie die Histogramme der Mindestabstände zwischen den beiden Flächen. Die Entfernungen zwischen kortikalen Oberflächen, die durch Abisolieren des MRT-Volumens erzeugt wurden, und Oberflächen, die aus 3D-Scans extrahierter Gehirne gewonnen wurden, wurden ausgewertet. Die Moduswerte des Histogramms der Entfernungen sind nur 55 Mikrometer.
Wenn sie das Histogramm von dem Punkt anakkumulieren, an dem der Abstand gleich Null ist, erreicht der akkumulierte Wert 90 % der gesamten Stichprobenzahlen bei etwa 300 Mikrometern. Das endgültige Histogramm der Abstände zwischen zwei Oberflächen zeigte einen typischen Spitzenwert von etwa 50 Mikrometern. Aus makroskopischer Sicht entspricht dieser Moduswert der geometrischen Begrenzung, die 100 Mikrometer von der Voxelgröße der MRTs entfernt war.
Dieser Punkt deutet indirekt darauf hin, dass der überlappende Algorithmus zwischen MRT und 3D-Scan hervorragend funktioniert hat und dass die Geräuschpegel sowohl des MRT als auch des 3D-Scans als niedriger Wert unterdrückt wurden. Dieses Protokoll ist das erste, das durch die Scan-Technologie zu Bioorganismus aufsteigt. Die Technologie wurde ursprünglich für rein technische Anforderungen eingesetzt.
Die Anwendung dieser Technologie auf die Medizin kann neue Fragen beantworten. Nach dem 3D-Scannen können wir Kalzium-Imaging-Wand-Patch-Gramm-Aufnahmen verwenden, um ergänzende Kenntnisse in Bezug auf zeitliche und räumliche Auflösung und rekordbare Anzahl von Zellen zu erhalten. Die hochpräzise Überlappungsleistung, die dieses Protokoll bietet, wird eine nahtlose Verknüpfung zwischen der anatomischen räumlichen Skala und der Null-Raumskala realistischer als zuvor.
