Ce protocole est le premier à introduire la technologie de numérisation 3D dans le domaine de la recherche anatomique, en particulier neuroanatomique, et a atteint des performances de chevauchement très précises. Le neuro-intégration 3D chevauchement, ou protocole neuro 3D, intègre des prises stériles à micro-échelle dans des images cérébrales macro-échelle, et les ponts de ces différentes échelles spatiales de façon transparente. Nous devons également appliquer le protocole neuro 3D aux IRM humaines et au cerveau post mortem.
Le chevauchement nous permet d’identifier les modèles connus de contraste d’IRM liés à la maladie. Les systèmes de balayage 3D sont sensibles à l’eau entourant le bio-organisme extrait, il est donc essentiel d’essuyer l’eau très soigneusement. En outre, la procédure doit être effectuée aussi rapidement que possible.
Commencez cette procédure par la préparation d’une souris, ainsi que par des acquisitions d’IRM et des préparations d’équipement décrites dans le protocole textuel. Le deuxième jour, couper le cuir chevelu d’une souris précédemment euthanasiée le long de la suture sagittale à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper le crâne dans des directions diagonales à partir du point lambda à un point un peu en face de la bregma.
Puis, décoller doucement le crâne du cerveau à l’aide d’une pince à épiler incurvée. Soulevez le cerveau à l’aide d’une spatule et transférez-le dans une boîte de Pétri avec une solution de coupe glacée. À l’aide d’une bombe à gaz externe à vitesse de pompe rotative contrôlée, l’air d’écoulement contient 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone pour générer de petites bulles dans la solution de coupe à froid.
Après une à deux minutes, mettre le cerveau sur un tissu de microfibre dont la surface est légèrement recouverte d’un tamis à farine. Essuyez doucement le liquide de la surface du cerveau à l’aide du tissu microfibre. Mettez le cerveau, avec son aspect dorsal vers le haut, sur le support d’échantillon.
Ensuite, placez le support de l’échantillon au centre de la plaque tournante automatique. Assombrissez la pièce pendant l’analyse 3D et effectuez un scan 3D sur la platine. Pour vérifier si l’analyse 3D fonctionne bien, cliquez sur 3D Scan en sélectionnant l’angle entre deux plans comme 22,5, l’angle de départ comme zéro, et l’angle final comme 360.
Déplacez le cerveau dans une boîte de Pétri et bouillonnez le cerveau dans la solution de coupe pendant environ 10 secondes. Couper le cerveau en deux blocs au milieu du plan coronal, à l’aide d’un scalpel. Ensuite, déplacez doucement les deux blocs cérébraux vers la surface plane à l’aide d’une spatule chirurgicale.
Fixez les blocs cérébraux de la base du bloc cérébral à l’aide de colle instantanée. Essuyez doucement et soigneusement le liquide de la surface du cerveau en une à deux minutes, à l’aide du tissu microfibre. Ensuite, effectuez à nouveau un scan 3D.
Fixez une lame au porte-lame du vibratome. Fixez le ruban noir couvrant le centre de la base du bloc cérébral au centre de la scène de coupe pour un vibratome. Verser la solution de coupe dans la scène de coupe et mettre la scène de coupe sur le vibratome.
Ajustez la vitesse de coupe et l’amplitude. Faire deux à cinq tranches coronale de 300 microns d’épaisseur à partir des deux blocs cérébraux. Gardez la solution dans l’étape de coupe bouillonnant si possible.
Optimisez la vitesse de coupe, la fréquence et l’amplitude vibratoire du système en les fixant comme 12,7 millimètres par minute pour la vitesse, 87 à 88 hertz pour la fréquence, et 0,8 à 1,0 millimètre pour la largeur de balançoire. Tout en coupant les tranches de cerveau, enregistrez la coordonnée tranchée dans le format, y compris la coordonnée antérieure-postérieure, l’hémisphère, et d’autres conditions. Transférer délicatement les tranches de cerveau dans un bécher rempli d’ACSF préchauffé à l’aide d’une pipette en plastique épaisse.
Incuber les tranches de cerveau dans le bécher à environ 34 degrés Celsius pendant une heure. Pendant ce temps, effectuez un balayage 3D des blocs de cerveau restants sur l’étape de coupe. Maintenant, réglez un tableau multiélecrode, ou puce MEA, sur une unité d’enregistrement.
Connectez la puce à une pompe périssaliste à l’aide de deux tubes. Utilisez un tube pour guider le même ACSF dans la puce MEA et l’autre tube pour guider l’ACSF hors de la puce MEA. Fixez deux aiguilles, reliées à l’extrémité des deux tubes, au sommet du mur de la puce MEA.
Fixez leurs positions avec leurs pointes suivant le mur intérieur de la puce MEA. Réglez le débit de l’ACSF à 4,1 RPM. Effectuez le traitement des données IRM pour extraire les volumes corticals tels que décrits dans le protocole texte.
Pour effectuer le traitement d’image IRM, téléchargez le logiciel libre Slicer 3D. Ouvrez les images MR des cerveaux extraits qui ont été produits à l’aide du rendu du volume et des modules d’éditeur dans la trancheuse 3D. Modifiez le mode de l’éditeur au rendu de volume, et cliquez sur un bouton cible pour faire venir l’image du cerveau au centre de l’écran.
Sélectionnez le mode cerveau MRT-2 et réglez les seuils en déplaçant la barre de décalage. Ensuite, revenez du rendu de volume à l’éditeur et cliquez sur le bouton d’effet de seuil. Appliquez l’étiquette 41, cortex cérébral.
Ensuite, enregistrez les données de surface du cerveau sous forme de fichier STL en changeant le format de fichier de VTK à STL sur la liste de contrôle du formulaire. Effectuez une coregistration automatique entre huit ou 16 images prises sous huit ou 16 angles différents dans une séquence d’un scan pour corriger les petits décalages. Pour ce faire, cliquez sur Enregistrement global inclus dans l’option d’alignement et intégrer les images.
Répétez les balayages sous différents angles pour obtenir toute la surface du cerveau. Si l’intégration entre les images numérisées sous différents angles n’a pas été couronnée de succès, cliquez sur Alignement manuel et sélectionnez une paire d’image fixe et une image en mouvement. Commencez l’alignement manuel des images en sélectionnant trois ou quatre points communs dans différentes images.
Ensuite, cliquez sur OK. L’algorithme d’optimisation est l’algorithme itératif le plus proche et n’inclut pas de déformation non linéaire. Faites un maillage de toutes les images alignées en sélectionnant toutes les images et en cliquant sur le bouton de génération de mailles. Ensuite, sélectionnez l’option, petit objet artistique, pour obtenir le maillage à la plus haute résolution.
Enregistrez l’image sous le nom de STL Binary ou de format ASCII. Maintenant, ouvrez la surface de l’IRM et fusionnez-la avec la surface de balayage 3D à l’aide du logiciel de traitement de surface. Effectuez un processus d’alignement manuel comme avant.
Ensuite, enregistrez à nouveau ces images de surface coregistered. Si nécessaire, nettoyez les données de surface individuelles en effanant les petits bruits entourant la région du cerveau, en particulier dans le cas des données IRM, et en remplissant tous les trous, en particulier dans le cas des données de balayage 3D. Enfin, ouvrez les données de surface avec des logiciels d’analyse de données tels que MATLAB.
Générer et évaluer les histogrammes des distances minimales entre les deux surfaces. Les distances ont été évaluées entre les surfaces corticales produites par le dépouillement du volume de l’IRM et les surfaces obtenues à partir de balayages 3D de cerveaux extraits. Les valeurs de mode de l’histogramme des distances ne sont que de 55 microns.
En outre, lors de l’accumulation de l’histogramme à partir du point où la distance est égale à zéro, la valeur accumulée atteint 90% du nombre total d’échantillons à environ 300 microns. L’histogramme final des distances entre deux surfaces a montré un pic typique autour de 50 microns. D’un point de vue macroscopique, cette valeur de mode correspond à la limitation géométrique, qui était de 100 microns de la taille voxel des IRM.
Ce point suggère indirectement que l’algorithme qui se chevauche entre l’IRM et l’analyse 3D a fonctionné superbement bien, et que les niveaux de bruit de l’IRM et de l’analyse 3D ont été supprimés comme une faible valeur. Ce protocole est le premier à être utilisé grâce à la technologie de numérisation au bio-organisme. La technologie a été utilisée à l’origine pour des demandes purement techniques.
L’application de cette technologie à la médecine peut répondre à de nouvelles questions. Après la numérisation 3D, nous pouvons utiliser des enregistrements de gramme de patch mur d’imagerie calcique pour obtenir des connaissances complémentaires en termes de résolution temporelle et spaciale et de nombres record de cellules. Les performances de chevauchement très précises que ce protocole fournit ront une association transparente entre l’échelle spatiale anatomique et l’échelle zéro spatial plus réaliste qu’auparavant.
