Agradecemos a Austin Ferro y Juao-Guilherme Rosa en el laboratorio de Cvetanovic por su ayuda en la resolución de problemas de disecciones y en la extracción de ARN y RTqPCR. Esta investigación está financiada por M. Cvetanovic, R01 NS197387; | del HHS Institutos Nacionales de Salud (NIH).

1. Configuración
<ol><li>Reúna el equipo necesario, incluidas las tijeras de decapitación, las yempadoras romas, las tijeras de disección, las tijeras vasculares, la microespatula, la matriz cerebral del ratón sagital, las cuchillas de afeitar, las puntas de pipeta de 200 μL, la placa de Petri de vidrio, el portaobjetos de vidrio y el cubo de hielo. Coloca todo el equipo en una almohadilla absorbente.</li>
	<li>Coloque la placa de Petri, la placa de vidrio y la matriz cerebral sobre hielo.</li>
	<li>Usando una cuchilla de afeitar en un ángulo perpendicular, recorte aproximadamente 5 mm de la punta de una punta de pipeta de 200 μL. Esto hace que el tamaño de la abertura en el extremo de la punta sea de aproximadamente 1 mm de ancho. Esto debería ser suficiente para perforar el DCN. Pero esto también se puede ajustar según sea necesario dependiendo de la disección. Tenga muchos consejos listos para un fácil reemplazo y ajuste.</li>
	<li>Etiquete los tubos de microfuge de 1,5 ml con identificación animal y región cerebelosa (cuatro tubos por animal).</li>
	<li>Llene el recipiente crioseguro con nitrógeno líquido para congelar el tejido después de la extracción.</li>
</ol>2. Extracción y disección cerebral
Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Comités de Cuidado de Animales de la Universidad de Minnesota.
<ol><li>Eutanasiar al ratón usando un 5% de exposición al CO2. Una vez que la respiración haya cesado, realice una luxación cervical. Decapita al ratón con las tijeras de decapitación y desecha el cadáver en el receptáculo apropiado.</li>
	<li>Haga una incisión con una cuchilla de afeitar a lo largo de la línea sagital medial de la cabeza comenzando en la nariz y continuando todo el camino hacia atrás. Separe la piel, separe a cada lado de la línea media. Use la cuchilla de afeitar para cortar el músculo de cada lado, cortando más allá de los canales auditivos.</li>
	<li>Usando tijeras de disección, recorte cualquier región de la médula espinal, hasta donde el tronco encefálico se encuentre con el cerebelo, con cuidado de no dañar el cerebelo.</li>
	<li>Inserte una de las hojas de tijera vascular en el espacio entre el tronco encefálico y la columna vertebral y corte hacia el canal auditivo, levantándose sobre las tijeras para cortar limpiamente el hueso pero limitar el daño al tejido.</li>
	<li>Continúe cortando a lo largo del borde del cráneo hacia los bulbos olfativos, continuando levantándose mientras corta para limitar el daño al tejido cerebral.</li>
	<li>Usando los bórceps contundentes, despegue suavemente la parte posterior del cráneo descubriendo la región posterior del cerebro y el cerebelo.</li>
	<li>Usando las pórceps romas a lo largo del borde del cráneo que se acaba de cortar, pelar el resto del cráneo hacia arriba y sobre el cerebro. Este paso debe eliminar la mayoría de la tapa del cráneo, revelando el cerebro.</li>
	<li>Recorte el resto del cráneo con las tijeras vasculares y las yórceps romas, limpiando la mayor parte del cráneo de la parte superior del cerebro.</li>
	<li>Usando la microespatula, levante el cerebro ligeramente y recoja debajo y deslice hacia arriba para eliminar los bulbos olfativos del cráneo restante y desconectar las fibras del tracto óptico. El cerebro debería liberarse fácilmente en este punto.</li>
	<li>Coloque el cerebro en la placa de Petri sentada sobre hielo y retire el cráneo restante u otros desechos.</li>
	<li>Usando la microespatula, coloque suavemente el cerebro en la matriz cerebral con el lado dorsal hacia arriba. Tómese el tiempo para asegurarse de que esté establecido en el nivel de la matriz, especialmente que la línea media caiga al centro de la matriz. Esta matriz está diseñada para el tejido cerebral de ratón adulto, el tejido de animales más jóvenes o enfermos puede descansar más abajo en la matriz, pero aún así debería ser posible lograr resultados reproducibles en todas las muestras.</li>
	<li>Coloque una cuchilla de afeitar a lo largo de la línea media sagital, asegurándose de que la cuchilla empuje hasta la parte inferior de la matriz(Figura 1B).</li>
	<li>Coloque otra hoja de afeitar de 1 mm al lado de la primera cuchilla (Figura 1B). Coloque dos cuchillas más a 1 mm de distancia entre sí. El resultado final debe ser tres cuchillas colocadas en un lado del cerebro, todas separadas por 1 mm. Haz lo mismo con el otro lado. En total, se colocarán 7 cuchillas separadas por 1 mm(Figura 1C).</li>
	<li>Con cuidado, agarre los extremos delantero y posterior de las cuchillas de afeitar y levántelas directamente de la matriz. El tejido en el exterior de las cuchillas de afeitar se puede desechar.</li>
	<li>Lentamente, separe una hoja de afeitar a la vez de las demás, teniendo cuidado de no dañar las secciones de tejido.</li>
	<li>Deslice con cuidado la sección de tejido de la hoja de afeitar y sobre el portaobjetos de vidrio con la microespatula. En total habrá seis secciones cerebrales sagitales(Figura 1D).</li>
	<li>Las 4 secciones más laterales tendrán DCN visible (cuadro púrpura, Figura 1D). Para aislar el DCN, sostenga la punta de pipeta recortada de 200 μL perpendicularmente sobre el DCN y empuje hacia abajo a través del tejido firmemente, balanceándose en todas las direcciones para diseccionar completamente el DCN del tejido circundante. Levante hacia arriba para eliminar limpiamente el DCN y confirme visualmente la presencia del tejido en la punta.</li>
	<li>Coloque un dedo en la parte superior de la punta y empuje hacia abajo, haciendo que el tejido sobresalga. Coloque la punta en un tubo de microfuge correctamente etiquetado y asegúrese de que el punzón de tejido se coloque en la parte inferior del tubo. Repita 2.17 para las tres secciones restantes, colocando los punzones DCN en el mismo tubo. Coloque el tubo en nitrógeno líquido para congelar el flash. Representación del tamaño de cada punzón en la Figura 1E.</li>
	<li>Las secciones que tenían DCN extraído califican como hemisferio cerebeloso. Aleje el resto del tejido cerebral alrededor del cerebelo en estas secciones. Use fórceps contundentes y recoja suavemente estas secciones de la corteza cerebelosa del hemisferio y colóquelas en el tubo de microfugio respectivo. Congelación de flash.</li>
	<li>Para las dos últimas secciones vermales (cuadro azul claro, Figura 1D),aleje el tejido cerebral circundante dejando solo el cerebelo. Con una cuchilla de afeitar, haga un corte que separe los lóbulos anteriores de los lóbulos posteriores. El corte debe ser justo después de la formación del lóbulo 6 y no debe incluir el lóbulo 10(Figura 1F).</li>
	<li>Usando fórceps contundentes, coloque cuidadosamente las secciones de la corteza cerebelosa anterior y las secciones de la corteza cerebelosa posterior en sus respectivos tubos de microfugios y congele el flash dejando los tubos en nitrógeno líquido durante 5 minutos. A partir de aquí, avance a la extracción de ARN, o puede almacenar los tubos a -80 ° C.</li>
</ol>3. Extracción de ARN 
NOTA: Este protocolo está modificado del Protocolo de Puerto de Cold Spring para la Extracción de ARN con TRIzol20. TRIzol solubiliza el material biológico, haciendo posible la extracción de ARN.
<ol><li>Coloque los tubos de microfuge en hielo para evitar que el tejido se descongele demasiado rápido, aplique 150 μL de TRIzol frío en el tubo de microfuge. Homogeneizar con un mortero esterilizado. Una vez que el tejido esté homogeneizado, pipetee la solución hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que no quede tejido intacto. Rompa aún más cualquier pedazo pequeño de tejido tirando de él en una jeringa de insulina varias veces.</li>
	<li>Agregue otros 350 μL de TRIzol y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Deje reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
	<li>Agregue 150 μL de cloroformo al tubo y agite vigorosamente y luego deje reposar durante 2-3 minutos. El cloroformo separa la solución tisular homogeneizada en fases (ARN, ADN y proteína).</li>
	<li>Centrifugar a 12.000 x g, a 15°C, durante 10 minutos. Asegúrese de que todos los tubos estén en la misma orientación.</li>
	<li>Retire cuidadosamente los tubos y ajuste la temperatura de la centrífuga a 4 ° C. Retire solo la fase acuosa clara en un nuevo tubo (este es el ARN), con cuidado de no interrumpir la interfase opaca (el ADN).  La fase más baja será roja y contiene proteínas. La solución restante en los tubos se puede guardar o desechar.</li>
	<li>Agregue alcohol isopropílico al 100% en una proporción de 1: 2 (si se eliminan 200 ul de fase acuosa, agregue 100 μL de alcohol isopropílico). Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. El alcohol isopropílico precipita el ARN fuera de la solución.</li>
	<li>Centrifugar a 12.000 x g, a 4°C, durante 10 minutos. Asegúrese de colocar todos los tubos en la misma orientación para que sea más fácil visualizar el pellet. El pellet resultante será el ARN extraído.</li>
	<li>Retire cuidadosamente los tubos, retire el sobrenadante con una pipeta teniendo cuidado de no interrumpir el pellet. El pellet es algo parecido a un gel y será difícil de ver, pero debe poder estimar dónde está en función de la orientación de los tubos en la centrífuga.</li>
	<li>Después de quitar todo el sobrenadante, agregue 500 μL de etanol al 75%, vórtice brevemente y centrífuga a 7500 x g, a 4 ° C, durante 5 minutos. El etanol lava aún más el pellet.</li>
	<li>Retire el sobrenadante con cuidado, sin interrumpir el pellet. Deje las tapas abiertas para secar la muestra. Esto generalmente toma de 5 a 10 minutos, pero puede variar dependiendo de la cantidad de etanol que quedó en el pellet. No seque en exceso.</li>
	<li>Una vez seco, vuelva a gastar el pellet en agua libre de DNasa. Agregue 20 μL a las muestras para DCN y 30 μL para todas las demás.</li>
	<li>Una vez resuspendidas, las muestras pueden almacenarse a -80 °C o proceder a pruebas adicionales.</li>
</ol>4. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RTqPCR)
<ol><li>Antes de este paso será necesario tratar el ARN con DNasa para eliminar cualquier ADN genómico y generar ADNc utilizando iScript de BioRad. Asegúrese de normalizar la concentración de ARN antes de hacer el ADNc. Además, es importante optimizar los cebadores para qPCR. Siga los métodos descritos aquí para completar este paso21. Breve descripción de la qPCR a continuación.</li>
	<li>Todos los cebadores se compran a IDT. Las secuencias hacia adelante y hacia atrás están en el mismo tubo de muestra y se almacenan a una concentración de 20x. Rps18 (gen de control): Adelante – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3' Reverso – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3' Parvalbúmina (proteína de unión al calcio, células inhibitorias): Adelante – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3' Reverso – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3' Kcng4 (subunidad del canal de potasio): Adelante – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3' Reverso – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3' Aldolasa C (Zebrin II, expresada diferencialmente a través de la corteza cerebelosa): Delantero – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3' Reverso – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGC-3'</li>
	<li>Las condiciones de qPCR fueron las siguientes. Periodo de preincubación, 5 minutos, a 95°C. Período de amplificación, 50 ciclos: 10 minutos a 95°C, 10 minutos a 62°C y 10 minutos a 72°C. Período de curva de fusión, 5 segundos a 95 ° C, un minuto a 65 ° C, y establezca la velocidad de rampa a .07 ° C / segundo hasta la temperatura objetivo de 97 ° C. Luego período de enfriamiento durante 10 minutos a 40 ° C.  Todas las reacciones de qPCR se realizaron por triplicado y la expresión génica se analizó utilizando 2- ΔΔCt con Rps18 como control de carga para normalizar la expresión génica. Se utilizó extracto cerebeloso a granel como referencia.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glia/neuron+ratio:+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution.">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li><li>Schmahmann, J. 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B., Diedrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+boundaries+in+the+human+cerebellum+revealed+by+a+multi-domain+task+battery.">Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery.</a> Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).</li><li>Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+the+human+cerebellum+estimated+by+intrinsic+functional+connectivity.">The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity.</a> Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).</li><li>Schmahmann, J. 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Los autores no tienen nada que revelar.

El método descrito aquí permite evaluar la expresión génica subyacente y los mecanismos moleculares dentro de cuatro regiones cerebelosas distintas: los núcleos cerebelosos profundos (DCN), la corteza cerebelosa anterior del vermis (CCaV), la corteza cerebelosa posterior del vermis (CCpV) y la corteza cerebelosa de los hemisferios (CCH). La capacidad de evaluar estas regiones por separado ampliará nuestro conocimiento de la heterogeneidad de regiones cerebelosas específicas y posiblemente arrojará luz sobre su co...

El cerebelo contiene más de la mitad de las neuronas en el cerebro e históricamente se ha referido como un centro de control motor y equilibrio en el cerebro1. Más recientemente, los estudios han demostrado que el cerebelo juega un papel clave en varias otras funciones, incluida la cognición, el procesamiento de recompensas y afectana 2,3,4,5.
El cerebelo tiene una anatomía bien descrita: la región de la corteza está compuesta de gránulos, Purkinje y capas moleculares. Las células granulares forman la capa celular granulada y envían entrada a través de fibras paralelas a las dendritas celulares de Purkinje de la capa molecular que también reciben entrada de fibras trepadoras que se originaron en la aceituna inferior. Las células de Purkinje envían proyecciones inhibitorias a las células en los núcleos cerebelosos profundos (DCN), que sirve como la principal salida del cerebelo. La salida de este circuito cerebeloso se modula aún más por la actividad de las interneuronas inhibitorias en la corteza cerebelosa, incluidas las células de Golgi, estrelladas y cesta4. Esta unidad funcional cerebelosa se distribuye por todos los lóbulos de la corteza cerebelosa. A pesar de este circuito relativamente uniforme a través del cerebelo, la evidencia de la literatura de neuroimagen humana y los estudios de pacientes indican heterogeneidad funcional del cerebelo6,7.
La corteza cerebelosa se puede dividir en dos regiones principales: el vermis definido en la línea media y los hemisferios laterales. El vermis se puede dividir en lóbulos anterior y posterior. Estas distintas regiones del cerebelo han sido implicadas en contribuir a diferentes comportamientos. Los patrones de actividad evocados por tareas o sin tareas implicaron que las regiones anteriores del vermis contribuyen más a la función motora, mientras que el vermis posterior contribuye más a la cognición6,7. El vermis también está relacionado con el afecto y las emociones, mientras que los hemisferios cerebelosos contribuyen a las funciones ejecutivas, visuales-espaciales, del lenguaje y otras funciones mnemotécnicas8. Además, los estudios anatómicos proporcionaron evidencia de que las regiones cerebelosas funcionalmente distintas están conectadas con diferentes regiones corticales9. El mapeo lesión-síntoma reveló que los pacientes con accidentes cerebrovasculares que afectan los lóbulos anteriores (que se extienden hacia el lóbulo VI) tuvieron un rendimiento más pobre en las tareas motoras finas, mientras que los pacientes con daño en las regiones del lóbulo posterior y los hemisferios exhibieron déficits cognitivos en ausencia de síndrome motor cerebeloso10. Finalmente, la patología cerebelosa regional en la enfermedad indica que las regiones cerebelosas funcionalmente distintas también son susceptibles de manera diferente a la enfermedad11,12.
Aunque mucho menos explorada, la evidencia preliminar demuestra distintas firmas de expresión génica en las regiones corticales cerebelosas. La expresión celular de Purkinje de Zebrin II muestra patrones específicos de la región en el vermis de tal manera que hay más células positivas de Zebrin II en los lóbulos posteriores y menos en los lóbulos anteriores13. Esto también se correlaciona con una función fisiológica regionalmente distinta, ya que las células de Purkinje negativas de Zebrin II muestran una mayor frecuencia de disparo tónico que las células de Purkinje que son Zebrin IIpositivas 14.
Además de la corteza cerebelosa, el cerebelo incluye los núcleos cerebelosos profundos (DCN) que sirven como la salida primaria para el cerebelo. Los núcleos están formados por los núcleos medial (MN), interpuesto (IN) y lateral (LN). Las imágenes funcionales y los estudios de pacientes han demostrado que el DCN también participa en varios comportamientos15, pero muy pocos estudios examinan el cambio de la expresión génica en dcN.
Los avances en las técnicas moleculares han hecho posible evaluar la expresión génica regional en el cerebro y han descubierto heterogeneidad a través y dentro de diferentes regiones del cerebro tanto en estados fisiológicos como de enfermedad16. Tales estudios implican que el cerebelo es diferente de otras regiones del cerebro. Por ejemplo, la proporción de neuronas a células gliales se invierte en el cerebelo en comparación con otras regiones del cerebro1. Incluso en condiciones fisiológicas normales, la expresión de genes proinflamatorios está regulada al alza en el cerebelo en comparación con las otras regiones del cerebro17. Las técnicas moleculares también han sido muy útiles para identificar las vías que contribuyen a la patogénesis de las enfermedades cerebelosas. Por ejemplo, la secuenciación de ARN de los extractos cerebelosos completos identificó genes alterados en un modelo de ratón transgénico específico de células de Purkinje de ataxia espinocerebelosa tipo 1 (SCA1) en comparación con sus controles de tipo salvaje. Dicha evidencia ha revelado vías moleculares clave que subyacen a la patogénesis en las células cerebelosas de Purkinje y ha ayudado a identificar posibles objetivos terapéuticos18. Sin embargo, estudios recientes sugieren que existen diferencias en la vulnerabilidad a las enfermedades en las regiones cerebelosas11,12,19. Esto podría indicar que hay cambios clave que ocurren en distintas regiones cerebelosas, que pueden enmascararse o no detectarse con extractos cerebelosos completos. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar técnicas que permitan a los investigadores examinar los perfiles moleculares en diferentes regiones cerebelosas.
La técnica propuesta aquí describe un método reproducible para diseccionar cuatro regiones distintas del cerebelo de ratón con el fin de aislar el ARN de esas regiones y explorar las diferencias regionales en la expresión génica. El esquema del cerebelo del ratón en la Figura 1A resalta el vermis en azul y los hemisferios en amarillo. En concreto, esta técnica permite aislar cuatro regiones: núcleos cerebelosos profundos (DCN) (cuadros de puntos rojos en la Figura 1A),la corteza cerebelosa del vermis anterior (CCaV) (azul oscuro en la Figura 1A),la corteza cerebelosa del vermis posterior (CCpV) (azul claro en la Figura 1A),y la corteza cerebelosa de los hemisferios (CCH) (amarillo en la Figura 1A). Al evaluar la expresión génica de estas regiones por separado, será posible investigar los mecanismos moleculares subyacentes a las funciones discretas de estas diferentes regiones, así como las posibles diferencias en su vulnerabilidad a la enfermedad.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 Microcentrifuge tubes</td>
			<td >ThermoScietific</td>
			<td >3456</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100% Isopropyl Alcohol</td>
			<td >VWR Life sciences</td>
			<td >1106C361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >200 ul Pipet tips</td>
			<td >GeneMate</td>
			<td >P-1237-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Brain Matrix Sagittal</td>
			<td >Kent Scientific Corporation</td>
			<td >RBMA-200S</td>
			<td></td>
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			<td >Blunt forceps</td>
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			<td >Chloroform</td>
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			<td >220905</td>
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			<td >Decapitation Scissors</td>
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		</tr>
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			<td >Dissecting Scissors</td>
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			<td >Ethyl Alcohol</td>
			<td >Pharmco</td>
			<td >111000200</td>
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			<td >Glass Slide (for electrophoresis)</td>
			<td >BIORAD</td>
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		</tr>
		<tr >
			<td >Homogenizer</td>
			<td >Kimble</td>
			<td >6HAZ6</td>
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			<td >Ice Bucket</td>
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		<tr >
			<td >Insulin Syringe (.5ml)</td>
			<td >BD</td>
			<td >329461</td>
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		<tr >
			<td >iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR</td>
			<td >BIORAD</td>
			<td >1725037</td>
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			<td >Micro Spatula</td>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle Nose forceps</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
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			<td >Petri Dish</td>
			<td >Pyrex</td>
			<td ></td>
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		<tr >
			<td >Primetime Primer for Aldolase C</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58&#62;43415246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Kcng4</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.56a.9448518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Parvalbumin</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.7596729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer Rps18&#160;</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.12109666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Edge Rzor Blades</td>
			<td >Personna GEM</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile, sigle-use pestles</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >12141364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol Reagent</td>
			<td >Ambion by Life technologies</td>
			<td >15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vascular Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebellar regional dissection for molecular analysis

El cerebelo juega un papel importante en varias funciones clave, incluido el control del movimiento, el equilibrio, la cognición, la recompensa y el afecto. Los estudios de imágenes indican que las distintas regiones cerebelosas contribuyen a estas diferentes funciones. Los estudios moleculares que examinan las diferencias cerebelosas regionales están rezagados, ya que se realizan principalmente en extractos cerebelosos enteros, enmascarando así cualquier distinción en regiones cerebelosas específicas. Aquí describimos una técnica para diseccionar de manera reproducible y rápida cuatro regiones cerebelosas diferentes: los núcleos cerebelosos profundos (DCN), la corteza cerebelosa vermal anterior y posterior y la corteza cerebelosa de los hemisferios. La disección de estas distintas regiones permite la exploración de los mecanismos moleculares que pueden subyacer a sus contribuciones únicas al equilibrio, el movimiento, el afecto y la cognición. Esta técnica también se puede utilizar para explorar las diferencias en la susceptibilidad patológica de estas regiones específicas en varios modelos de enfermedad de ratón.

Para estos experimentos, se utilizaron cuatro ratones salvajes hembra de once semanas de edad tipo C57 / Black6. Se utilizó un ratón para realizar una disección cerebelosa completa que se conoce como "cerebelo a granel" y permitió la comparación de los niveles de ARN en regiones disecadas con una disección completa. Los otros tres ratones se utilizaron para realizar la disección cerebelosa descrita en este protocolo. El uso de tres ratones permite garantizar que las tendencias dete...

Watch this Scientific Journal Video about Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis at JoVE.com

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Se ha implicado que diferentes regiones cerebelosas desempeñan un papel en distintos resultados conductuales, sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes siguen siendo desconocidos. Este trabajo describe un método para diseccionar de manera reproducible y rápida la corteza cerebelosa de los hemisferios, las regiones anterior y posterior del vermis y los núcleos cerebelosos profundos con el fin de sondear las diferencias moleculares mediante el aislamiento del ARN y la prueba de las diferencias en la expresión génica.

Disección regional cerebelosa para análisis molecular

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.8K vistas.  University of Minnesota. Se ha implicado que diferentes regiones cerebelosas desempeñan un papel en distintos resultados conductuales, sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes siguen siendo desconocidos. Este trabajo describe un método para diseccionar de manera reproducible y rápida la corteza cerebelosa de los hemisferios, las regiones anterior y posterior del vermis y los núcleos cerebelosos profundos con el fin de sondear las diferencias moleculares mediante el aislamiento del ...

Video: Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously published phenotype assessments in several disease models, including spinocerebellar ataxias, Huntington s disease and spinobulbar muscular atrophy. Measures include hind limb clasping, ledge test, gait and kyphosis. Each measure is recorded on a scale of 0-3, with a combined total of 0-12 for all four measures. The results effectively discriminate between affected and non-affected individuals, while also quantifying the temporal progression of neurodegenerative disease phenotypes. Measures may be analyzed individually or combined into a composite phenotype score for greater statistical power. The ideal combination of the four described measures will depend upon the disorder in question. We present an example of the protocol used to assess disease severity in a transgenic mouse model of spinocerebellar ataxia type 7 (SCA7).
Albert R. La Spada and Gwenn A. Garden contributed to this manuscript equally.

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebellar ataxia. Measures include hind limb clasping, ledge test, gait and kyphosis. This protocol effectively discriminates between affected and non-affected individuals, and detects the progression of affected individuals over time.

A simple fenotipo compuesto el sistema de puntaje para la evaluación de modelos de ratón de Ataxia cerebelosa

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Investigación

Neurociencias

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotípicos Culturas del cerebelo: Retos y detección de apoptosis

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Solo Drosophila Omatidio disección e Imagen

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Análisis cuantitativo de Reposición Synaptic piscina vesículas en cultivos de neuronas granulares del cerebelo con tintes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Disección, Cultura y Análisis de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tejido de la retina embrionaria

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Disección Del Músculo Transverso Abdominis Para El Análisis De La Unión Neuromuscular De Montaje Completo

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser Nanocirugía del cerebelo Los axones<em&gt; En Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto<em&gt; Drosophila</emLos cerebros&gt;

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...