El objetivo general de este procedimiento es presentar un enfoque experimental optimizado para aislar los tejidos embrionarios de los embriones de codornices y pollos. Con esta técnica, obtenemos tejidos embrionarios puros que se pueden utilizar en estudios de expresión génica y ensayos funcionales. Los tejidos de los embriones de codorniz y pollo están aislados por microcirugía y están sujetos a una digestión enzimática in vitro, preservando al mismo tiempo sus propiedades biológicas.
Después del aislamiento, los tejidos preservados tridimensionales se pueden utilizar para el análisis de patrones de expresión génica topográfica de alta resolución. Este enfoque es particularmente útil para detallar la expresión génica in situ en territorios embrionarios de otro modo inaccesibles por métodos convencionales. Además, los enfoques de análisis de transcriptomas también se pueden aplicar en tejidos aislados sin necesidad de marcadores genéticos, al tiempo que proporcionan un análisis oémico de alto rendimiento específico del tejido.
Alternativamente, los tejidos aislados de ambas especies se pueden asociar en un ensayo organotípico in vitro durante 48 horas. Este enfoque permite estudiar las interacciones de los tejidos, ya que las células de codornices y pollos pueden ser discriminadas por características nucleares y marcadores moleculares distintos. La capacidad de los tejidos de cultivo para formar órganos se puede probar aún más en el ensayo ovo.
Por lo tanto, este método es una herramienta útil para estudiar interacciones complejas de tejidos en procesos de desarrollo con modificaciones espaciales altamente dinámicas y también puede ayudar a revelar el potencial de territorios embrionarios específicos a la formación de órganos. Como ejemplo, en este documento se describe la formación de timo quimérico de codornices-pollo a partir de tejidos embrionarios aislados. En primer lugar, el endodermo de la tercera y cuarta bolsa faríngea, el rudimento tirámico prospectivo se aísla de la región faríngea de embriones de codorniz con tres días de desarrollo.
Entonces, este tejido se asocia con un mesenquime capaz de apoyar su desarrollo, el mesodermo somatopleura. Finalmente, la asociación heteroespecífica de los tejidos se cultiva in vitro y en ovo para formar un timo quimérico. Realice todos los procedimientos de manipulación de óvulos en condiciones estériles utilizando una campana de flujo laminar horizontal e instrumentos y materiales esterilizados.
Los huevos de codorniz fertilizados fueron incubados con la cámara de aire hacia arriba. Para comenzar, retire los huevos de codorniz de la incubadora. Prepare un tazón grande de vidrio borosilicato lleno de PBS frío.
Con tijeras curvadas, toque y corte un agujero circular en la cáscara de un huevo de codorniz con tres días de incubación. Haga el agujero en el lado opuesto del huevo contundente, y transfiera la yema al tazón con PBS frío. Retire el embrión de la yema cortando la membrana vitellina externamente a vasos extramblarónicos.
Con la ayuda de fórceps delgados, transfiera el embrión a un tazón pequeño lleno de PBS frío, luego mueva el embrión a un plato de Petri con base negra con un skimmer. Retire la región faríngea que contiene la tercera y cuarta bolsas faríngeas como se describe en la ligadura anterior de Jove SPA. Luego, transfiera la tercera y cuarta región del arco faríngeo a un vaso que se llene de pancreatina fría e incubar durante una hora, sobre hielo, para la digestión enzimática.
Tenga en cuenta que el período de incubación de la digestión enzimática depende de la etapa de desarrollo. Coloque la placa de vidrio debajo del microscopio estéreo y aísle el endodermo de la tercera y cuarta región del arco faríngeo, utilizando dos microescalpelos en un soporte. Primero coloque la región faríngea con el lado dorsal hacia arriba, mostrando internamente el endodermo y el ectodermo en la superficie externa.
Observe el ectodermo, el endodermo, el mesenquime, el tubo cardíaco y la porción ventral del tubo neural. Retire el tubo neural y el mesodermo unido a la superficie dorsal del endodermo faríngeo. Observe el endodermo de la faringe, la cuarta y tercera bolsas faríngeas y el tubo cardíaco.
Con el lado dorsal hacia arriba, desprende cuidadosamente y retire el mesenquime entre los arcos faríngeos y exponga las bolsas faríngeas. Realice este procedimiento en el otro lado de la región faríngea. Retire el mesenquimo unido a la parte más posterior del endodermo y observe la cuarta bolsa faríngea.
Con el lado posterior hacia arriba, observe las bolsas faríngeas izquierda y derecha. Continúe retirando el mesenquime unido a la parte más posterior del endodermo y a la segunda bolsa. Retire el tubo cardíaco y el mesenquime que rodea las bolsas interiores.
Con el lado ventral hacia arriba, observe el endodermo de faringe, y el lado derecho del segundo arco faríngeo. En esta etapa, el endodermo del rudimento tiroideo debe ser visible. Separar el ectodermo del segundo y tercer arco faríngeo y eliminar cuidadosamente el mesenquime de los arcos.
Observe la extirpación del mesenquime del segundo arco faríngeo en el lado derecho. Tenga en cuenta la ubicación de la cuarta y tercera bolsas y el rudimento tiroideo. Retire los restos de las células mesenquimales unidas a las bolsas faríngeas.
Observe la tercera y cuarta bolsa del lado derecho y la cuarta bolsa del lado izquierdo. Repita el destacamento de mesenquime del lado izquierdo. Observe ahora la tercera bolsa del lado izquierdo.
Observe el desprendimiento de mesenquime del segundo arco en el lado izquierdo. Tenga en cuenta que todas las superficies y soluciones deben mantenerse frías durante este procedimiento. Cambiar a una nueva solución y plato de pancreatina fría en caso de tomar mucho tiempo para diseccionar los tejidos.
Finalmente, hacer un corte transversal entre la segunda y la tercera bolsas faríngeas para eliminar las segundas bolsas y el rudimento tiroideo. En este punto, el endodermo aislado se compone de la tercera y cuarta bolsas faríngeas y la punta posterior de la faringe. Retire los restos de mesenquime separados con la ayuda de dos microescalpelos.
Transfiera el endodermo aislado a un plato de vidrio lleno de suero bovino fetal frío y manténgalo sobre hielo durante la preparación del ensayo in vitro. Los huevos se colocaron en posición horizontal y la parte superior marcada para el uso de un carbón vegetal. Para comenzar, retire los huevos de la incubadora.
Con una tijera curva, abra un pequeño agujero en la cáscara, inserte una aguja y aspire dos mililitros de albúmina con una jeringa de 10 mililitros. Abra un agujero circular en la región marcada de la cáscara y corte la membrana vitellina externamente a los vasos embrionarios adicionales mientras sostiene el embrión con fórceps delgados. Bajo un microscopio estéreo, coloque el embrión en un plato de Petri con base negra que contenga PBS frío.
Utilice cuatro pasadores de insectos para sujetar el embrión en la parte inferior de la placa. Coloque los pasadores en la región extraembónica formando una forma cuadrada. Realizar dos cortes entre las somitas 19 y 24 transversalmente al eje embrionario y cruzar el embrión.
Suelte esta sección cortando los bordes embrionarios marginales. Observe la placa lateral, el tubo neural y las somitas. Aspirar y transferir los tejidos a un plato de vidrio lleno de pancreatina fría.
Incubar durante 30 minutos sobre hielo para la digestión enzimática. Bajo el microscopio estéreo, aísle el mesodermo de los tejidos circundantes utilizando dos microescalpelos en soportes. Observe el mesodermo somatopleura, la esplancnopleura, el tubo neural y el ectodermo.
En primer lugar, retire el ectodermo en la superficie. Observar el mesodermo somatopleura disociado del ectodermo. Luego, separe cuidadosamente la splanchnopleura situada ventralmente de la somatopleura.
Observe el mesodermo lateral derecho de la somatopleura. Suéltelo cortándolo en un movimiento paralelo al tubo neural. Tenga en cuenta que todas las superficies y soluciones deben mantenerse frías durante este procedimiento.
Cambiar a una nueva solución y plato de pancreatina fría en caso de tomar mucho tiempo para diseccionar los tejidos. Observe el mesodermo lateral izquierdo de la somatopleura, los somites, el tubo neural y el ectodermo. Repita la liberación del mesodermo de este lado.
Realiza movimientos lentos con el microescalpelo. Las proteínas de matriz extracelular expuestas se asientan a través de tejidos e instrumentos, evitando movimientos de fluidos. Corte cuidadosamente la somatopleura en un movimiento paralelo al tubo neural.
Transfiera el mesodermo aislado a un plato de vidrio lleno de suero bovino fetal frío y manténgalo sobre hielo durante la preparación del ensayo in vitro. Coloque una rejilla de metal mallada fina en un plato de Petri y llene con un medio de cultivo. Retire los líquidos excesivos para nivelar la superficie media con la parte superior de la rejilla.
Con la ayuda de fórceps delgados, sumerja un filtro de membrana en el medio de cultivo y colóquelo cuidadosamente en la parte superior de la rejilla para tener una superficie en contacto con ella. Bajo el microscopio estéreo, transfiera el endodermo aislado del plato de vidrio al filtro de membrana deslizando suavemente con la ayuda de espátulas y fórceps delgados. Repita este procedimiento para el mesodermo aislado.
Con la ayuda de un microescalpelo, mezcla los tejidos para maximizar su asociación. Coloque cuidadosamente los tejidos asociados en una incubadora humidificada a 37 grados con 5%CO2 durante 48 horas. Después del período de incubación, injerte los tejidos de cultivo en la membrana de tipo coriolan y permita que se desarrolle en óvalo durante 10 días para completar la formación de órganos como se describió anteriormente.
Aquí está el método reticular que permite el aislamiento de los tejidos embrionarios aviares para ser utilizado en enfoques experimentales distintos. Como ejemplo, la expresión de genes que se sabe que participan en la formación de las bolsas faríngeas también se evaluó un endodermo aislado que contenía la segunda, tercera y cuarta bolsas faríngeas de embriones de pollo en el día embrionario tres y medio por hibridación en el monte in situ. La expresión de Sonic Hedgehog fue detectada en el endodermo de la faringe central y excluida de las bolsas, mientras que BMP7 se expresó en el endodermo de la segunda y tercera bolsas faríngeas y se excluyó de la faringe central y la cuarta bolsa faríngea.
Los tejidos aislados también pueden ser asociados específicamente in vitro durante 48 horas, injerto en la membrana de tipo coriolan, y permitidos desarrollarse durante 10 días más. Los explantes pueden ser analizados por histología convencional e inmunohistoquímica. Algunos resultados representativos de la asociación del endodermo de codornices de la tercera y cuarta bolsa faríngea con mesodermo de somatopleura de pollo son los siguientes injertos mostraron un timo quimérico completamente formado con células epiteliales timicas derivadas de codornices positivas para QCPN y células linfoides de pollo.
Además, el epitelio timico positivo de citoqueracina mostró rasgos morfológicos normales, mostrando una arquitectura reticular típica. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo aislar los tejidos embrionarios de codorniz y pollo que se pueden utilizar en estudios de expresión génica y mediante la formación de órganos quiméricos también puede ayudar a descifrar la complejidad de la genética orgánica.
