Hola, soy Kai Jin de la Universidad de Yangzhou. En nombre de nuestro grupo de investigación voy a presentar una poderosa herramienta del embrión de pollo en la investigación del desarrollo. El embrión de pollo es un modelo de desarrollo clásico que se ha utilizado para investigar el desarrollo y la diferenciación, de hecho, las medidas extrañas del laboratorio en embriones de pollo son una herramienta valiosa para la biología del desarrollo, como la transfección genética, la reproducción transgénica y la preparación transmural gonadal.
En nuestro laboratorio, hemos establecido los métodos de inyección de tipo mu, pero para muchos investigadores, el detalle de la inyección no está claro y es difícil de alinear. Así que en este video, vamos a mostrar los detalles de la inyección vascular durante la etapa temprana del desarrollo embrionario de pollo en ovo. No dude en ponerse en contacto con nosotros si está interesado en ello.
Aquí, mostramos los detalles del protocolo. Recolección y preparación de óvulos fertilizados. Primero, a diferencia de los mamíferos, el pollo tiene millones de folículos en un solo ovario, pero solo unos pocos de estos folículos son lo suficientemente maduros como para ovular.
Cada folículo contiene un ovocito o célula germinal. Tan pronto como el folículo madura y libera su yema, se incorpora al embudo de la trompa de Falopio. A medida que el folículo entra en el abdomen yugular del oviducto, el semen se une al huevo en el cuerpo de la gallina y el calcio en el cuerpo de la gallina forma una cáscara que envuelve el huevo fertilizado formando un huevo de cáscara suave en el cuerpo.
Las cáscaras de calcio se espesan gradualmente hasta que se produce el huevo. Recoja el óvulo fertilizado, académicamente llamado huevos embrionarios y colóquelos cuidadosamente en un estante en una incubadora a 37.8 grados Celsius y 60% de humedad. Los embriones se incuban en condiciones adecuadas.
Después de dos días de incubación, aparecen pequeños puntos rojos pulsantes llamados corazones primordiales. Este proceso se llama batido de cerezas. Alrededor de los 2,5 días, los vasos sanguíneos son visibles y se han formado los segmentos del corazón y el cuerpo.
Preparación de agujas y plásmidos. Utilizamos capilares de vidrio como agujas. Antes de la inyección, prepare capilares de vidrio con el diámetro exterior de un milímetro y el diámetro interno de 0,6 milímetros.
Los materiales exógenos suelen ser plásmidos, lentivirus empaquetados y células germinales primordiales, o PGC. En este video, usamos el azul tripano para mostrar el rastro de los materiales inyectados. Ventanas. Antes de exponer los embriones, necesitamos esterilizar los embriones para evitar la contaminación por gérmenes.
Esto se hace limpiando suavemente la superficie de los embriones con una bola de algodón con 75% de alcohol en el sitio de la abertura del huevo. Después de la desinfección, golpee suavemente el extremo romo de la cáscara del huevo con fórceps y corte cuidadosamente un agujero de 0,5 centímetros por 0,5 centímetros en la superficie de la cáscara del huevo con las pinzas para exponer el embrión. Inyección intravascular in-ovo.
Mire la vista bajo el microscopio, ajuste el enfoque del microscopio para localizar primero el embrión y luego encuentre los vasos sanguíneos del embrión de pollo listos para la inyección. Apunte la aguja con la sustancia exógena al vaso sanguíneo, observando que la aguja es paralela al vaso sanguíneo que se inyecta. Inserte la aguja suavemente en el vaso sanguíneo y luego encienda la bomba de aire.
En este punto, la sustancia extraña ingresa a la arteria y, con el latido del corazón, circula de regreso al embrión a través de la arteria y luego a la vena. Hay dos tipos de inyecciones vasculares. La primera es una inyección en la cabeza donde la sustancia extraña se inyecta desde una vena en la cabeza del embrión y fluye de regreso al corazón.
La otra es una inyección aórtica dorsal donde la sustancia extraña circula al embrión con el latido del corazón. Con el latido del corazón embrionario y la circulación de la sangre podemos ver claramente que el material extraño es recibido por los capilares al final de la arteria, en la vena y luego regresa al embrión desde la vena, lo que indica que el material extraño inyectado se entrega efectivamente a cada parte del embrión. Después de la inyección, retire el óvulo del estereomicroscopio, corte un trozo de cinta médica de tres centímetros de largo con tijeras pequeñas y conecte la cinta a la abertura.
Raspe suavemente la cinta con las tijeras para exprimir las burbujas de aire y luego corte otro trozo de cinta para sellar la abertura en una cruz. Después de sellar la abertura, los embriones inyectados se colocan cuidadosamente de nuevo en la incubadora. Aquí mostramos las imágenes representativas de embriones de pollo post inyección.
La primera imagen muestra el resultado de la inyección de plásmido lentivirus. La fluorescencia verde bajo un microscopio de fluorescencia estereoscópica indica la expresión exitosa del plásmido inyectado en embriones. Esto sugiere la viabilidad de la inyección intravascular de plásmidos en embriones de pollo.
La segunda imagen muestra los resultados de la inyección de PGC. Los PGC fueron etiquetados con RFP. En esta imagen pudimos ver los PGC inyectados que son los puntos rojos aquí, ubicados en la gónada de los receptores.
Esto indica que los PGC del donante pudieron entrar y colonizar en la gónada de los receptores de manera efectiva. En conclusión, este protocolo presenta el proceso de inyección intravascular in-ovo de materiales exógenos, plásmidos o PGC en embriones de pollo. El método que se muestra aquí es fácil de seguir y aprender y vale la pena la aplicación en muchos campos.
Esto es todo lo que me gustaría compartir con ustedes. Espero que este enfoque facilite su trabajo como una poderosa herramienta de investigación en el establecimiento de embriones de pollo y la biología del desarrollo. Gracias por ver este video y buena suerte con su investigación.
