Creación de quimeras del cerebro anterior aviar para evaluar el desarrollo facial

Este método permite a los investigadores evaluar las interacciones tisulares entre el prosencéfalo basal y la cara. La principal ventaja de esta técnica es que aísla el prosencéfalo basal para la evaluación y evita la contaminación con células de la cresta neural, lo que confundiría el análisis. La parte difícil de esta técnica es la extracción del cerebro anterior del huésped y el reemplazo con el tejido del donante.

Demostrando el procedimiento estará Diane Hu, una científica investigadora del laboratorio del Dr. Ralph Marcucio. Para comenzar, prepare medios DMEM con rojo neutro, una pipeta de transferencia de vidrio y tungsteno afilado. Con una jeringa de 10 mililitros y una aguja de calibre 18, retire 0,5 mililitros de albúmina del extremo puntiagudo de la cáscara del huevo.

Haz un pequeño agujero en la parte superior de la concha usando la punta de las tijeras. Luego coloque un trozo de cinta sobre el agujero y corte una abertura circular para exponer el embrión. Mancha el embrión con rojo neutro.

Recolectar injertos de tejido del lado izquierdo del prosencéfalo basal de embriones en etapa siete u ocho. Use agujas curvas de tungsteno afiladas para incidir suavemente un pedazo del cerebro anterior. Para no incluir el endodermo subyacente, deslice la aguja debajo del cerebro anterior y paralela al eje del tubo neural.

Recoger el injerto del embrión donante utilizando la pipeta de transferencia de vidrio, y transferirlo a DMEM que contiene rojo neutro durante dos minutos para teñirlo. Luego coloque el injerto teñido en DMEM que no contenga rojo neutro hasta que esté listo para el injerto. Incubar huevos fertilizados de pollo Leghorn blanco a 37 grados centígrados en una cámara humidificada hasta la etapa siete a ocho de Hamburger-Hamilton.

Exponer los embriones como se demostró anteriormente. Usando agujas de tungsteno afiladas, prepare el sitio del injerto cortando y luego extrayendo una pieza de 0.3 por 0.2 milímetros de prosencéfalo basal para acomodar el injerto. Evite la interrupción excesiva del endodermo subyacente, que será evidente ya que los gránulos de yema comenzarán a filtrarse a través de cualquier desgarro que se haga.

Después de transferir el injerto al huésped, coloque el injerto para reemplazar el prosencéfalo basal extirpado del huésped. Coloque la cinta firmemente sobre el orificio y devuelva los embriones a la incubadora de 37 grados centígrados hasta que estén listos para el análisis. Inicialmente, las quimeras se crearon trasplantando tejidos de codorniz en embriones de pollo.

Usando el anticuerpo QCPN, las células de codorniz se visualizaron y distinguieron de los tejidos del huésped. El sistema de codorniz-polluelo confirmó que todo el injerto estaba compuesto solo de tejido neural y no estaba contaminado con otros tipos de células. El trasplante de tejido de codorniz en embriones de pato condujo a quimeras severamente deformadas debido a un cerebro de codorniz de desarrollo más rápido.

Por lo tanto, se realizó el trasplante de tejidos de pato en embriones de pollo. Las quimeras pato-polluelo resultantes sugieren que el cerebro participa en la regulación de la morfología. Se utilizó la hibridación C2 de montaña entera para evaluar la expresión del erizo sónico en quimeras.

Similar a la morfología, la expresión del erizo sónico en el lado del pato de la quimera parecía más parecida a la de un pato. La preparación del sitio host requiere práctica. Una gran cantidad de embriones no sobreviven, por lo que crear una gran cantidad de quimeras puede ayudar a garantizar muestras adecuadas para el análisis.

Este método permitió evaluar cómo las señales del cerebro dan forma al dominio de expresión del erizo sónico en la zona ectodérmica frontonasal.