El trabajo fue apoyado por becas de Helse og Rehabilitering (JLB), el Consejo Noruego de Investigación (GH y GCC) y la Universidad de Oslo (NK y JCG).

1. Aislamiento y cultivo de células madre humanas y la preparación para la inyección en embriones <ol><li> Las células madre humanas utilizadas como ejemplos en este protocolo (cerebro, tejido adiposo, la médula ósea) se encuentran aislados de manera diferente a los diferentes tejidos. Por ejemplo, células madre neurales adultas aisladas a partir de piezas de tejido recogidas de la pared ventricular del cerebro durante la neurocirugía endoscópica, que luego se disocia en las células individuales que son cultivadas in vitro. Las células madre neuronales se forman espontáneamente neuroesferas que flotan en el medio de cultivo, mientras que otros tipos de células se adhieren al fondo del plato 7. Derivadas de tejido adiposo células madre mesenquimales se obtienen a partir de material de liposucción que se digiere enzimáticamente y se esforzó para eliminar el tejido fibroso y luego se centrifuga para eliminar los adipocitos maduros. Las células resultantes se resuspenden en medio de cultivo suplementado con suero para promover la proliferación de las células madre en otros tipos de células madre hematopoyéticas y 8 células progenitoras pueden ser aislados de aspirados de médula ósea por la selección positiva utilizando anticuerpos específicos conjugados con partículas magnéticas (Myltenyi Biotec, Alemania o Dynal-Invitrogen, EE.UU.) y la separación de células magnéticas y / o el uso de anticuerpos conjugados con fluoróforos y de fluorescencia de clasificación de células activadas (FACS) 9. </li><li> Para facilitar la posterior identificación, identificar a las células madre con un marcador fluorescente antes de la implantación en embriones de pollo. Las células madre pueden ser etiquetados con tintes fluorescentes lipofílicos como DII (Invitrogen, EE.UU.) o PKH26 (Sigma, EE.UU.), utilizando los protocolos recomendados proveedor hasta poco antes de la implantación, o, para una etiqueta permanente con esencia, no hay peligro de contaminación de las células huésped, pueden ser transducidas con el gen para una proteína fluorescente como la proteína fluorescente verde, utilizando vectores lentiviral, mientras que aún en la cultura 10. </li><li> Protocolos para el cultivo y propagación de células madre humanas pueden variar. Protocolos detallados se pueden encontrar en la literatura. En pocas palabras, la formación de la esfera de células madre son generalmente cultivadas en frascos, mientras que las células madre son generalmente adherente en placas de Petri (que facilitan la trituración cuando se divide, ver más abajo), en un medio apropiado. Para el corte o cosecha, pellet ámbito de formación de las células por centrifugación de 5 minutos a 1200rpm y resuspender en pre-calentado tripsina / EDTA solución para no más de 5 minutos a 37 grados centígrados. Para células adherentes añadir la solución de tripsina / EDTA a la placa de Petri, y triturar al final de 5 minutos. Terminar la tripsina mediante la adición de Ca 2 +-medio que contiene, a veces se complementan con la albúmina. Para eliminar la tripsina / EDTA, centrifugar las células (5 min a 1200rpm), separar el sobrenadante, resuspender en el vehículo de inyección en frío (por lo general media o tampón fosfato salino), y centrifugar de nuevo (5 min a 1200rpm). Eliminar la mayor parte de este sobrenadante y resuspender suavemente las células para crear una suspensión de células de alta concentración. </li><li> Mantener la suspensión de células madre humanas en un pequeño frasco tapado o un tubo de microcentrífuga en hielo durante varias horas antes de la inyección. La supervivencia en este estado puede ser del tipo celular dependiente. El vehículo de inyección debe ser optimizada de acuerdo a las propiedades de las células, incluyendo su adhesividad (por ejemplo, un vehículo de bajo Ca 2 + puede ayudar a prevenir la formación de grumos) y la resistencia a los cambios de la hipoxia y el pH. </li></ol> 2. De incubación de huevos y la preparación <ol><li> Tienda de los huevos fertilizados en una cámara de refrigeración (por ejemplo: Termaks, Bergen, Noruega) a los 14-15 ° C antes de la incubación. En esta evolución de la temperatura se detiene hasta que comienza la incubación. Los huevos fertilizados almacenados durante más de 10 días a temperaturas más bajas tienen un menor índice de desarrollo posterior y la supervivencia. </li><li> Para reiniciar el desarrollo, poner los huevos en una incubadora humidificada, de tiro forzado (por ejemplo: Binder, Nueva York, EE.UU.) a 38-39 º C, y se incuban hasta la etapa de desarrollo deseado se alcanza (para la puesta en escena, véase la referencia 11. ). </li><li> Antes de abrir el huevo, la creación de una bolsa de aire por encima del embrión mediante la inserción de una aguja de calibre 18 jeringa a través de la cáscara del huevo (no muy profundamente para evitar perforar la yema) y la evacuación de 4 ml de albúmina (figura A). Esto crea una caída de presión que en cuestión de minutos se iguala con la entrada de aire a través de la cáscara porosa. Cuando el aire entra recoge en el punto más alto dentro de la cáscara, separando así el embrión de la superficie interna de la cáscara. </li><li> Sellar el agujero creado por la aguja de la jeringa con cinta de plástico convencionales. </li></ol> 3. Tirando de micropipetas de vidrio <ol><li> Tire de micropipetas de vidrio de borosilicato (por ejemplo, 1,2 mm OD x 0.94 mm de diámetro, Harvard Apparatus, EE.UU.) en un extractor de electrodos convencionales (por ejemplo, el modelo P-2000, Sutter Instruments, EE.UU.). Ajustar la configuración de extractor para obtener micropipetas que tienen alta resistencia de entrada cuando se usa como microelectrodes. Consejos debe ser aproximadamente de 1 a 1,5 cm de largo. Los ejes se pueden marcar a intervalos de 1 mm para el cálculo de volúmenes expulsado. </li><li> Rompa las puntas de micropipeta de un tamaño viable, doblando con una pinza o empujar contra una superficie sólida, mientras que ver con un microscopio. La ruptura debe ser lo más uniforme posible en todo el perímetro del vidrio y el diámetro interno resultante en la punta debe adaptarse al tamaño de las células para ser utilizados sin que se tape. Normalmente, un 20-30 micrones de diámetro interior funciona bien. </li></ol> 4. Preparación de la solución rápida tinte verde (reactivo de contraste) <ol><li> Prepare una solución al 0,1% (w / v) de colorante verde rápido (Sigma-Aldrich, EE.UU.) mediante la disolución en solución salina fisiológica de pollo (137 mM NaCl, 5 KCl, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, 1 mM Na- fosfato, HEPES 5 mM, 11 mM de glucosa, pH 7,4). </li><li> Filtrar la solución rápida a través de un verde 0,22 m Millex GP filtro (Millipore Co., Bedford, EE.UU.). </li></ol> 5. La apertura de los huevos y el contraste de los embriones <ol><li> Coloque dos trozos de cinta adhesiva en la parte superior del huevo, que abarca las dimensiones de la bolsa de aire. Mantener el huevo orientado de manera que el área de grabado (y por lo tanto la bolsa de aire) es más alta, corte una pequeña ventana dentro de las fronteras del área de grabado con una tijeras de disección resistente. La cinta incluye soporte y ayuda a prevenir los fragmentos de cáscara de huevo se cae sobre el embrión. Las burbujas de aire asociada con la bolsa de aire se pueden hacer estallar con la parte de atrás de una punta de la pipeta de plástico o sonda roma otros. </li><li> Dibuja una solución Fast Green en una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 25. Eliminar las burbujas de aire en la jeringa y la aguja. Doblar la aguja a un ángulo de 45 grados, penetrar en un punto fuera de la placa embrionaria (identificados por el anillo de los vasos sanguíneos que se circunscriben, perforación dentro de la placa embrionaria aumenta la mortalidad) y con cuidado la aguja guía en el embrión. Inyectar el tinte hasta que el contraste deseado. El embrión, que normalmente es transparente, ahora se destacan como un fantasma blanquecino contra el color verde oscuro (figura B). Muchos investigadores el uso de tinta India (diluido al 10% v / v) en lugar de Fast Green. En este caso, es importante la utilización de tinta china que no es tóxico, como Pelikan Fount tinta china. </li></ol> 6. Hacer hindbrain y lesiones de la médula espinal del tubo neural <ol><li> Producir afilado agujas de tungsteno por la llama de grabado corto (2-3 cm) de 100 piezas de varilla de tungsteno micras de diámetro (número de catálogo 719000, A &amp; R Sistemas, Seattle, Washington), con un soplete de acetileno / oxígeno. Esto se realiza mediante la inserción de la punta de la vara muy brevemente en la llama del soplete hasta que una chispa que se ve, lo que representa la erosión de explosivos de las capas externas de tungsteno, dejando tras de sí una punta afilada. </li><li> Usando una aguja afilada de tungsteno, y cortar a través de desviar la membrana vitelina que cubre el área de microcirugía. </li><li> En una segunda aguja afilada de tungsteno (la punta de la aguja primero es a menudo dañado después de cortar a través de la membrana vitelina y no es apta para la microcirugía posteriores), cortar cuidadosamente a través del epitelio del tubo neural y desviarla, luego se corta alrededor y debajo de la pieza del tubo neural que se retira, con movimientos cortos y rápidos hacia arriba (figura C). Hacer los cortes transversales y luego los cortes longitudinales es usualmente más exitosa. No corte demasiado profundo o se arriesga a penetrar en los vasos sanguíneos subyacentes, que generalmente es fatal. </li><li> Mueva suavemente o arrastrar la pieza de tejido resecado lejos del sitio de la lesión con la aguja de tungsteno. Si esto resulta difícil, sino que también se puede quitar, por aspiración boca con una micropipeta de vidrio conectada a un tubo flexible. </li></ol> 7. La inyección de células madre humanas a. La inyección en una lesión del tubo neural Dibuja una pequeña cantidad de células en la punta de una micropipeta de vidrio por succión la boca mediante un tubo de plástico. La concentración de trabajo de la suspensión celular debe ser optimizado para el tipo de célula que se inyecta. Monte la micropipeta en un micromanipulador y conectarlo a una bomba de microinyector (por ejemplo: PV830 PicoPump neumático, IPM, Washington, EE.UU.). Bajo control visual, utilizando un microscopio de disección, guía de la punta de la micropipeta en la lesión y cuidadosamente saque a las células mediante el aumento de la presión del aire (ya sea por pulsos de presión constante o de forma gradual el aumento gradual de la presión) (Figura C). Cuando la cantidad deseada de células se deposita en el sitio de la lesión, con cuidado retirar la micropipeta. b. La inyección en el lumen del tubo neural En algunos casos puede ser conveniente para inyectar las células en los ventrículos del cerebro en desarrollo, por ejemplo si las células son invasivas suficiente para ganar acceso al tejido neuronal en ausencia de lesiones. La inyección de células en el lumen de los brain región requiere el uso de una etapa de desarrollo en el que la luz ofrece un receptáculo lo suficientemente grande y es de fácil acceso; etapas HH 12-18 son favorables en este sentido. Una lesión no es necesario. Simplemente perforar la pared del tubo neural con la micropipeta de vidrio antes de la inyección de las células. Los elementos clave para el éxito de este método son la nitidez de la micropipeta y la brusquedad de la penetración, muy lento el movimiento y la punta de la micropipeta sólo hoyo en la pared del tubo neural, sin penetrar. c. Inyección sistémica Inyecciones sistémicas se pueden hacer a través de los vasos sanguíneos extra-embrionario (a partir de la etapa HH 15, cuando los buques están bien desarrollados). Esto no es poco común acompañado de un poco de sangrado, y ya que hay muchas pequeñas arterias y venas más grandes menos, intra-arterial inyecciones son generalmente más seguras cuando se trata de la supervivencia del embrión. Por otro lado, inyecciones intravenosas proporcionar un acceso más rápido de las células del corazón y por lo tanto probablemente una distribución más equitativa de las células. Una inyección de éxito requiere una micropipeta afilada con un diámetro menor que el buque de destino. Acercarse a la embarcación a lo largo de su eje en un ángulo pequeño respecto a la horizontal (unos 30 grados). Empuje la micropipeta contra el buque hasta que el barco comienza a ocluir. A continuación, pulse más de una empresa, el movimiento brusco de penetrar. Retraer lentamente hasta que la sangre se ve a llamar por la acción capilar en la punta de la micropipeta. La inyección de células se debe realizar con una presión constante, después de que la micropipeta se retira con un movimiento rápido. 8. Sellado del huevo <ol><li> Después de la inyección, deje que el huevo de pie quieto durante unos minutos para permitir que las células inyectadas para resolver y cumplir. Para evitar la deshidratación (que puede ocurrir rápidamente y puede ser mortal), poner un pedazo de tejido húmedo o papel de filtro en la ventana durante este período de descanso. </li><li> Después de unos minutos y las células se han establecido, la cáscara seca alrededor de la ventana y el sello de la ventana con cinta de plástico convencionales. Asegúrese de que este sello es firme y que no la albúmina puede a través de la apertura o entre el depósito y la cinta (con frecuencia es fatal durante la incubación posterior). </li><li> Vuelva a colocar los huevos a la incubadora de tiro forzado para un mayor desarrollo. La observación puede hacerse a intervalos mediante la eliminación de la cinta sobre la ventana. </li></ol> 9. La disección de embriones <ol><li> Una vez que el embrión se ha llegado a la etapa deseada, crack abrir el huevo en un tazón de helado de solución salina fisiológica o buffer fosfato salino (la cinta que cubre la ventana debe ser el primer corte para permitir que las dos mitades de la cáscara del huevo para separar). La solución salina helada sirve para anestesiar el embrión de la hipotermia. El corazón debe disminuir rápidamente y detener a un par de minutos. </li><li> Separar el embrión a partir de las membranas extraembrionarias y el escenario que con ref. 11. </li><li> Decapitar a los embriones, la transferencia a un plato de disección que tiene un piso de caucho de silicona y solución salina oxigenada contiene fisiológicas suplementado con glucosa (137 mM NaCl, 5 KCl, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, 1 mM Na-fosfato, 5 mM HEPES, 11 mM de glucosa, pH 7,4) y el pin lado ventral hacia arriba rápido. Retire las vísceras abdominales y torácicas. Usando una tijera en ángulo, hacer incisiones longitudinales a lo largo de cada aspecto ventrolateral de la columna vertebral. Especialmente en las etapas posteriores (después de 6 días de desarrollo), la incisión inicial se realiza mejor en la región lumbosacra, donde el espacio entre las vértebras y la médula espinal es mayor. Retire la cara ventral de la columna vertebral para revelar la médula espinal. Asegúrese de que la solución salina fisiológica sigue siendo oxigenada por burbujeo en unos intervalos de 10 minutos con oxígeno medicinal puro. </li><li> Corte con cuidado las raíces dorsales y ventrales naciente a cada lado, transecto de la médula espinal en los niveles deseados, y sacarlo con cuidado del canal vertebral. La médula espinal va a sobrevivir durante muchas horas en este estado y puede ser sometido a 12 anatómicos y fisiológicos 13,14 experimentos. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2071/2071fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. A) El enfoque adecuado para la evacuación de la albúmina. Tenga en cuenta la posición del embrión y la colocación de la aguja. B) En contraste de los embriones. Tenga en cuenta el punto de penetración de la aguja fuera del disco embrionario. C) Representación esquemática del procedimiento para la lesión medular unilateral del tubo neural seguida de trasplante de células.

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El embrión de pollo es un modelo animal conveniente y versátil para los experimentos de xenotrasplante. La falta de un sistema inmune funcional durante el desarrollo embrionario y fetal, permite la supervivencia y el desarrollo de las células de cualquier especie que tolera la temperatura de incubación. Embriones de pollo se han utilizado para poner a prueba el potencial regenerativo de los distintos tipos de células madre (revisado en ref. 15). Las células de mamíferos madre pueden integrarse en los tejidos de embrión de pollo, incluyendo el sistema nervioso central, donde pueden dar lugar a neuronas cuyas proyecciones axonal, la conectividad sináptica y las propiedades electrofisiológicas se puede evaluar en el contexto del 1,2 funcional circuitos neuronales. Debido a que los procedimientos quirúrgicos son relativamente fáciles, y las inyecciones se realizan bajo el control visual en lugar de estereotáxica, el número de embriones se puede incrementar fácilmente para adaptarse a diferentes condiciones experimentales en un solo experimento. Normalmente las células se pueden inyectar en 20-30 embriones dentro de un experimento de cuatro horas. La mortalidad después de la inyección de los embriones es el principal factor limitante. Se deben tomar precauciones para evitar la hemorragia y la deshidratación. Tenga en cuenta que hay ciertas etapas críticas del desarrollo en que los aumentos naturales de la tasa de mortalidad. Que complementa el embrión con unos pocos mL de inyección caliente, esterilizados timbre de pollo y el día siguiente antes de las etapas críticas del desarrollo, así como asegurar que la ventana en el huevo esté bien sellada y orientada a evitar las fugas, mejora la supervivencia. Si la fuga a través del precinto debe ocurrir, retire la cinta, secar las superficies y volver a la cinta. Algunos investigadores utilizan la cera y el vidrio o cubreobjetos de plástico para sellar la ventana. La mortalidad no debe ser sustancialmente diferente en comparación con inyección de operación simulada embriones. Aunque nos hemos centrado aquí en la inyección de células madre humanas en el esbozo del cerebro y la médula espinal, las células madre también pueden ser inyectados en el esbozo de otros órganos (véase, por ejemplo, ref. 4). Cada órgano plantea sus propios desafíos. Por ejemplo, la inyección en el corazón puede ser un reto debido a la alta resistencia mecánica a la penetración de la pipeta y debido a los movimientos, que por otro lado puede ser frenado por el enfriamiento de los embriones a temperatura ambiente antes de la inyección. Los órganos que carecen de una luz no puede dar cabida a la inyección de un volumen suficiente y por lo tanto puede requerir lesión quirúrgica para crear un receptáculo. En nuestra experiencia, después de la lesión la regeneración de tejidos es una ventaja, ya que promueve la integración de las células madre humanas en el tejido. Las células también pueden ser inyectados en mesénquima embrionario, como el mesénquima somitic dispersión o de la cresta neural migran como una forma de lograr su incorporación en derivados mesenquimales, incluyendo la cresta neural derivados de los ganglios periféricos 16,17.

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xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo

El embrión de pollo es un modelo animal clásico para estudiar el desarrollo embrionario y fetal normal, y para los experimentos de xenotrasplantes para estudiar el comportamiento de las células en un estándar<em&gt; In vivo</em&gt; Medio ambiente. Las principales ventajas de los embriones de pollo son de bajo costo, de alta accesibilidad, la facilidad de la manipulación quirúrgica y la falta de un sistema completamente desarrollado inmunidad. Xenotrasplantes en embriones de pollo puede proporcionar información valiosa sobre la proliferación celular, la diferenciación y el comportamiento, las respuestas de las células a las señales definidas en nichos tejido embrionario, y el potencial carcinogénico. El trasplante de células en embriones de pollo también puede ser un paso hacia los experimentos de trasplante en modelos animales. Recientemente, el embrión de pollo se ha utilizado para evaluar el potencial neurogénico de la madre humanas y las células progenitoras después de la implantación en el primordio neural<sup&gt; 1-6</sup&gt;. En este vídeo podemos documentar todo el procedimiento de trasplante de células madre humanas en el desarrollo del sistema nervioso central del embrión de pollo. El procedimiento se inicia con la incubación de los huevos fecundados hasta que los embriones de la edad deseada se han desarrollado. La cáscara del huevo se abre entonces, y el embrión al inyectar medio de contraste entre el embrión y la yema. Se realizan pequeñas lesiones en el tubo neural mediante microcirugía, la creación de un sitio para la deposición de regeneración celular que promueve la posterior integración en el tejido del huésped. Demostramos inyecciones de células madre humanas en este tipo de lesiones realizado en la parte del tubo neural que forma la parte posterior del cerebro y la médula espinal, y en la luz de la parte del tubo neural que se forma el cerebro. Inyecciones sistémicas en las venas y las arterias extraembrionarias que también se demuestre como una forma alternativa de administrar células a los tejidos vascularizados como el sistema nervioso central. Finalmente se muestra cómo extraer el embrión del huevo después de varios días de desarrollo y cómo analizar la médula espinal libre para su posterior análisis fisiológicos, histológicos y bioquímicos.

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Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

En este trabajo se presenta un método para el trasplante de células madre humanas en varias regiones del sistema nervioso central del embrión de pollo. Esto proporciona una<em&gt; In vivo</em&gt; Modelo para evaluar la proliferación y diferenciación de los distintos tipos de células madre humanas en entornos de tejido embrionario.

Xenotrasplante de células madre humanas en el embrión de pollo

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.2K vistas.  University of Oslo. En este trabajo se presenta un método para el trasplante de células madre humanas en varias regiones del sistema nervioso central del embrión de pollo. Esto proporciona una In vivo Modelo para evaluar la proliferación y diferenciación de los distintos tipos de células madre humanas en entornos de tejido embrionario.

Video: Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

Propagación de la madre embrionarias humanas (ES) Células

Investigación

Biología

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection reagents has often resulted in poor cell viability and low transfection efficiency.  Other mechanical methods of introducing a gene of interest, such as a &#8220;gene gun&#8221; or microinjection, are also limited by poor cell viability and low numbers of transfected cells.  The strategy of using viral constructs to introduce an exogenous gene into primary cells has been constrained by both the amount of time and labor required to create viral vectors and potential safety concerns.  We describe here a step-by-step protocol for transfecting hNSPCs using Amaxa's Nucleofector device and technology with electrical current parameters and buffer solutions specifically optimized for transfecting neural stem cells.  Using this protocol, we have achieved initial transfection efficiencies of ~35% and ~70% after stable transfection.  The protocol entails combining a high number of hNSPCs with the DNA to be transfected in the appropriate buffer followed by electroporation with the Nucleofector device.

Introducing a gene of interest into a cell is a powerful method for elucidating its function in vivo. This protocol describes an efficient method of transfecting a culture of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) using the Nucleofector electroporation apparatus made by Amaxa.

Transfección de células madre neurales humanas con el Nucleofector Amaxa

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

Conteo de células madre neurales humanas

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

Pases células madre neurales humanas

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest, most commonly a protein, in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable researchers to conserve primary and secondary antibodies while getting high quality, reproducible qualitative and quantitative data out of their staining. There are two aspects of this protocol that help to conserve the volume of antibody necessary for staining. For one, the cells are grown on small, circular coverslips that are placed in wells of a tissue culture plate. After fixation, the cells on coverslips can be removed from the wells of the plate. For antibody staining, the coverslip with cells is inverted onto a small drop of antibody solution on parafilm and is covered with a second piece of parafilm to prevent drying. Using this method, only ~25 &mu;l of antibody solution is needed for each coverslip (or sample) to be stained. This protocol describes immunostaining of human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can be used for many other cell types.

Immunocytochemistry is a powerful method to determine the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable one to conserve antibodies and get the most out of one's staining.

Inmunocitoquímica: células madre neurales humanas

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

En Electroporations Ovo de embriones de pollo HH Etapa 10

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

La diferenciación de células madre embrionarias en los precursores de oligodendrocitos

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral mediada por derribo Durante Ex Vivo Eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

La reprogramación de células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) utilizando el vector retroviral con las buenas prácticas agrarias

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...