Nuestro protocolo describe cómo ensamblar y caracterizar eléctricamente una biomembrana dopada con péptidos que imita estrechamente la composición, estructura y propiedades de transporte de las sinapsis biológicas y que exhibe una resistencia a la memoria sintonizable. Esta técnica permite a los usuarios evaluar la resistencia a la actividad, la resistencia a la memoria y la plasticidad a corto plazo en sistemas de ingeniería a escalas de tiempo y niveles de excitación relevantes para las sinapsis biológicas y los canales iónicos. Esta técnica proporciona un marco para caracterizar membranas biomiméticas que contienen canales iónicos activados por voltaje, por lo que es aplicable a la caracterización de una variedad de procesos de transporte celular, incluyendo aquellos en las neuronas.
Nuestra sugerencia a los nuevos investigadores es que primero se vuelvan competentes en la preparación de soluciones liposomas y el montaje de una bicapla de interfaz de gotas en electrodos de tipo alambre. Ver de primera mano el proceso de dosificación y posicionamiento de gotas en electrodos simplifica esta técnica para la formación de bicapas, haciéndola inmediatamente accesible para todos. Joseph Najem, un postdoctorado de mi laboratorio.
Para empezar, preparar la solución de alamethicina en el tubo de microcentrífuga disolviendo los péptidos de alamethicina en polvo en etanol a una concentración final de 2,5 miligramos por mililitro. Vórtice el tubo brevemente para mezclar bien, y almacenar la solución de stock en un congelador celsius de menos 20 grados. En un tubo Safe-Lock de 1,5 mililitros, añada un microlitro de solución de stock de alamethicina a 99 microlitros de la solución A para lograr una concentración final de almethicina de 13 micromolares en la suspensión liposoma.
Vórtice para mezclar bien. La solución liposoma de péptido resultante es la solución B.Mix 117 microlitros de la solución A con 10 microlitros de la solución B para lograr una concentración final de alamethicina de un micromolar, y luego vórtice para mezclar bien. Refiera a la solución resultante como C.Store las soluciones B y C en cuatro grados Celsius.
Coloque un lado de vidrio de un milímetro de grosor de 25 veces 75 milímetros en el escenario de un microscopio invertido. Dispensar unas gotas de aceite de hexadecano en el centro del portaobjetos de vidrio, y luego colocar el depósito de aceite directamente sobre el aceite en el portaobjetos de vidrio. Llenar completamente el depósito de aceite con aceite de hexadecano.
Asegúrese de que el depósito esté situado por encima del objetivo. A continuación, conecte el soporte del electrodo a la etapa principal de un amplificador de corriente montado en un micromaniprógrafo. El micromaniprógrafo minimiza la longitud del electrodo y el ruido eléctrico.
A continuación, monte el soporte de micropipeta de vidrio con el segundo cable de cloruro de plata y plata en otro micromaniprógrafo. Usando los micromanipuladores, coloque los electrodos de manera que las puntas recubiertas de agarosa de los cables de cloruro de plata-plata estén completamente sumergidas en el depósito de aceite en un plano vertical similar. Alinee los dos electrodos y sepárelos unos pocos milímetros.
Para formar la bicala lipídica, mueva los electrodos verticalmente a la fase de aceite. Utilice la micropipeta para depositar 200 nanolitros de la solución lipídica A en cada uno de los cables. Espere de tres a cinco minutos para permitir que el ensamblaje espontáneo de la monocapa de lípidos se produzca en la interfaz del aceite de agua.
Las gotas pueden hundirse si el aceite circundante es lo suficientemente menos denso. Después de eso, baje los electrodos para volver a sumergirse hasta que los extremos de ambos electrodos apenas toquen el fondo del depósito de aceite. Luego, para formar la bicacapa, mueva los electrodos horizontalmente para poner las gotas en contacto.
Para obtener la relación pellizcada, histérica y de voltaje de corriente, utilice un generador de funciones para aplicar una forma de onda de voltaje triangular o sinusoidal a una membrana lipídica libre de alamethicina montada con gotas de la solución A.Registre la respuesta de corriente inducida a través de múltiples frecuencias. Para registrar el tamaño de la bicacapa lipídica interfacial, mida el diámetro de la membrana lipídica en la computadora o registre la amplitud de corriente pico a pico resultante de la onda triangular de 10 hercios y 10 milivoltios para calcular el área de la membrana. Saque los cables de la fase de aceite para eliminar las gotas que no contienen alamethicina.
Agregue nuevas gotas acuosas utilizando la solución C y forme una bicapila lipídica. Basado en la amplitud de corriente de onda cuadrada, utilice los micromanipuladores para ajustar el contacto entre gotas, de modo que la bicaplaca tenga un área similar a la formada anteriormente. A continuación, aplique una forma de onda de voltaje de 10 hercios y 10 milivoltios, y registre la respuesta de corriente inducida como anteriormente.
Para llevar a cabo experimentos de pulso utilizando un software de programación personalizado y una fuente de voltaje analógico, genere pulsos de voltaje con amplitudes altas y bajas específicas en tiempo y tiempo de espera. Registre la corriente en respuesta a los pulsos aplicados. La gráfica de corriente frente a voltaje muestra la respuesta de corriente no cero tras la aplicación de un sesgo de voltaje a una bicala de lípidos libre de almethicina.
Añadir 0.017 hercios, una frecuencia donde la impedancia está dominada por la resistencia a la membrana. Se muestra una respuesta de baja corriente ohmica para la membrana altamente aislante. La gráfica de una bicala lipídica formada entre dos gotas que contienen péptidos de almethicina muestra corrientes de aumento exponencial a tensiones superiores al umbral de inserción de 100 milivoltios.
A alta tensión, los péptidos de almeticina que residen en la superficie de la bicapo lipídica se insertan en la membrana y se agregan para formar poros conductores. Las respuestas de corriente simétrica en ambas polaridades se deben a la inserción y agregación de poblaciones separadas de péptidos de lados opuestos de la membrana. La corriente capacitiva debe restarse de la corriente total para obtener sólo la respuesta de tensión de corriente de histéresis memristiva y pellizcada.
La respuesta del memristor biomolecular a pulsos de voltaje subsiguientes con un aumento en la conductividad durante el tiempo, a pesar de restaurar intermitentemente un estado aislante durante cada tiempo de apagado. Tanto el estímulo actual como los estímulos previos contribuyen al aumento actual. Los monocapas cohesivos en ambas gotas deben formarse antes de reunirlos para formar la bicacapa.
Si las gotas se juntan demasiado pronto, se unen y no se forma ninguna bicapla. Ahora estamos diseñando y fabricando redes neuronales de base microfluídica que consisten en neuronas de estado sólido conectadas por sinapsis basadas en membranas soportadas por la optimización de la asimilación de la red de supercomputadoras de alto rendimiento en ORNL. Estos memristors son los primeros en tener la composición, estructura, mecanismo de conmutación y transporte iónico de sinapsis biológicas.
Por lo tanto, proporcionan una base biomolecular amueblada añadiendo computación cerebral y memoria.
