El análisis celular en tiempo real de xCELLigence le permite monitorear cuantitativamente la muerte de células cancerosas por células inmunitarias en condiciones libres de etiquetas y en el transcurso de varios días. Este sistema proporciona un curso de tiempo completo de la muerte de células cancerosas objetivo que permite el cribado simultáneo de un gran número de construcciones, tipos de células efectora o terapias combinadas con un efector bajo a relaciones objetivo. Comience por sembrar 1,5 veces 10 a las siete células HEK293FT en el medio de cultivo DMEM en un plato de cultivo celular de 150 mililitros para una incubación nocturna a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono con humedad.
A la mañana siguiente, mezcle 2,5 mililitros de solución de dilución de transfección complementados con cinco microgramos de ADN plásmido vectorial lentiviral y 22,5 microgramos de mezcla de envasado lentiviral con 82,5 microlitros de reactivo de transfección en 2,5 mililitros de solución de dilución de transfección. Después de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, transfiera la gota de reacción sabia en el plato de las células HEK293FT y devuelva las células a la incubadora para una segunda incubación durante la noche. A la mañana siguiente, reemplace el sobrenadante con 19 mililitros de medio de cultivo DMEM fresco y devuelva las células a la incubadora durante la noche.
Recoger el sobrenadante en un solo tubo cónico de 50 mililitros para un almacenamiento de cuatro grados Centígrados durante los próximos dos días antes de sedimentar el lentivirus por centrifugación en la segunda mañana con el fin de eliminar las células o desechos de la solución. Transfiera todo menos un mililitro del lentivirus que contiene sobrenadante a un tubo de centrífuga ultra claro para la ultracentrifugación. Después de la ultracentrifugación, aspirar cuidadosamente el virus residual que contiene sobrenadante, añadir suavemente 100 microlitros de DMEM al pellet, y colocar el tubo sobre hielo durante 15 minutos.
Al final de la incubación, mezcle la solución suavemente y aliquot la solución de lentivirus en tubos estériles pre-refrigerados para su almacenamiento a menos 80 grados Celsius. A continuación, determine el título del lentivirus por RT-PCR cuantitativo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la generación y expansión de células CAR-T, active de una a dos veces 10 a las seis células mononucleares de sangre periférica en un mililitro de medio celular CAR-T con un número igual de microperlas recubiertas CD3/CD28 en un pozo de una placa de 24 pozos en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas.
Las siguientes dos mañanas, mezclar un microlitro de agente potenciador de transducción con las células seguido de la adición de lentivirus en una multiplicidad de infección de cinco a uno. Monitorear el crecimiento de la célula T cada dos o tres días agregando medio de células CAR-T frescos según sea necesario para mantener las células en una o dos veces 10 a las seis células por concentración de mililitro. Para detectar la expresión de la célula T CAR por citometría de flujo, transfiera tres veces 10 a la quinta célula CAR y células T no transducidas en tubos de microcentrífuga individuales de 1,5 mililitros.
Recoger las células por centrifugación y resuspender los pellets en 200 microlitros de tampón FACS complementado con 1%suero humano. Divida cada muestra de célula en 100 alícuotas de microlitros en tubos individuales de poliestireno FACS de cinco mililitros sobre hielo. Después de cinco minutos, agregue un microlitro de fragmentos FAB2 biotinilados de FAB2 antiratón de cabra FAB2 a un tubo de cada tipo de célula y dos microlitros de anticuerpo antietiquetado con etiqueta PE al otro tubo de cada tipo de célula con una mezcla completa.
Después de 30 minutos sobre hielo, lave las células con tres mililitros de tampón FACS fresco y después de centrifugar decantar los sobrenadantes. Resuspender los pellets en el sobrenadante restante y añadir dos microlitros de APC anti-CD3 y dos microlitros de 7-AAD a cada tubo. Añadir un microlitro de Streptavidin con etiqueta de PE con una breve mezcla en el tubo manchado con anticuerpos anti-FAB2 e incubar todos los tubos sobre hielo durante 30 minutos.
Al final de la incubación, analice las células por citometría de flujo de acuerdo con los protocolos estándar que gating las células T por dispersión hacia delante contra dispersión lateral y expresión CD3 frente a 7-AAD. Para un ensayo de potencia de citolisis en tiempo real, agregue de 50 a 100 microlitros del medio de cultivo celular objetivo a cada pozo de una placa electrónica y mida la impedancia de fondo en un instrumento de analizador celular. Detecte las células cancerosas diana de la placa de cultivo usando trippsina.
Lavar las células en 15 mililitros de cultivo fresco medio y centrífuga. Resuspender el pellet de células cancerosas en cinco mililitros de medio fresco para contar y ajustar la densidad celular a la concentración celular objetivo adecuada. Agregue las celdas al número adecuado de pozos y deje la placa electrónica durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que las células se asienten uniformemente en la parte inferior de los pozos.
Al final del período de equilibrio, coloque la placa en el analizador de células en tiempo real e inicie la medición de la impedancia automáticamente cada 15 minutos durante la noche. La adhesión y proliferación de las células de destino se puede rastrear en tiempo real. A la mañana siguiente, diluir el efector CAR y controlar las células T a la concentración adecuada en tubos individuales y eliminar 50 a 100 microlitros de cada pozo de la placa electrónica para que el volumen final en cada pozo sea de 100 microlitros.
A continuación, sembrar el efector y controlar las células T en los pozos apropiados en las proporciones de efector a objetivo adecuadas en 100 microlitros de medio por pozo. A continuación, equilibre la placa electrónica durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de devolver la placa al sistema analizador celular. Para medir la eficacia de la muerte mediada por células T de las células cancerosas objetivo, monitoree la matanza mediada por CAR-T durante 96 horas.
Alrededor del 50% de las células CAR-T se tiñen positivamente para el anticuerpo de fragmento variable de cadena anti-única que indica la expresión de CAR en aproximadamente el 50% de las células T. En este experimento representativo, se utilizó una relación de efector a destino de 10 a uno para todos los grupos. Las células Raji solamente y las células T CD22-CAR trataron las células Raji mostraron una matanza significativa en comparación con la célula T de control solamente y los grupos de células Auto-T de Mock.
En este experimento, sólo las células CD47-CAR-T fueron eficaces para matar las células cancerosas pancreáticas. Además, la señal de impedancia de las células CD47-CAR-T por sí sola estaba ligeramente por encima de la señal de índice de celda medida en los pozos medios solos, lo que indica que la señal de impedancia resultante de las células de suspensión como las células CAR-T es mínima y no contribuye a la señal de impedancia general cuando las células CAR-T se agregan a las células cancerosas de destino. En particular, se observó que el dominio coestimulatorio de la GITR era más eficaz para mejorar la matanza de células CAR-T contra las células diana positivas del receptor del factor de crecimiento epitelial en comparación con las construcciones originales de la CAR sin el dominio GITR.
El medio de los pozos de placas electrónicas se puede recoger para analizar el perfil de citoquinas en los puntos de tiempo, ya sea durante o después del ensayo de acuerdo con las necesidades del experimento. En general, xCELLigence ha mejorado la eficiencia de la evaluación de la potencia de diversas inmunoterapias que van desde los activadores de células T bi-específicas y los virus oncolíticos hasta los inhibidores del punto de control inmune en las terapias combinadas.
