Este método puede ayudar a responder a preguntas clave en el campo de la inmunoterapia sobre la evaluación de la citotoxicidad de las células inmunitarias contra las células tumorales de la estructura 3D. Las principales ventajas de este método son que es sencillo y combina tecnología de imagen avanzada y un ensayo inmunológico sensible. Comience lavando la línea de interés de la célula de cáncer colorrectal con cinco mililitros de PBS y retirando las células del fondo del matraz con 0,5 mililitros de trippsina durante cinco minutos a 37 grados centígrados.
Después de confirmar el desprendimiento bajo un microscopio, neutralice la enzima de disociación celular con 10 mililitros de medio completo y recoja las células por centrifugación. Resuspender el pellet en cinco mililitros de medio fresco completo para contar y resuspender las células a una concentración de 1,5 veces 10 a las terceras células por mililitro. A continuación, sembrar 200 microlitros de células en cada pozo de placa inferior redonda de 96 pozos y colocar la placa en un aparato de imágenes automatizado dentro de una incubadora de 37 grados Celsius con 5% de CO2 y 95% de humedad.
Inicie sesión en el software de adquisición del aparato y seleccione Programar para adquirir, Lanzar añadir buque, Escanear a la programación y Crear buque nuevo. A continuación, seleccione el tipo de escaneo Esferoide y seleccione los canales de interés y de campo brillante apropiados. Ajuste el aumento a 10 veces y seleccione el modelo de placa y su posición dentro del cajón del aparato de imágenes.
Seleccione la posición de los pozos a ser objeto de una imagen e introduzca la descripción del experimento, incluido el nombre, el tipo de celdas y el número de celdas. Para la configuración del análisis, seleccione Aplazar análisis hasta más tarde, haga clic con el botón derecho en la línea de tiempo y seleccione Establecer intervalo de grupo de análisis seleccionado y establezca Agregar exploraciones cada cuatro horas y Para un total de 24 horas. A continuación, establezca la hora de inicio en al menos una hora después de la incubación en el aparato de imágenes automatizado.
Para comprobar el progreso del crecimiento del esferoide, cada dos días, inicie sesión en el software de imágenes y seleccione Ver análisis recientes. Haga doble clic en el experimento de interés y seleccione Campo de iluminación en el panel Canales de imagen. A continuación, utilice la herramienta Medir entidades de imagen para medir el diámetro de los esferoides, añadiendo 50 microlitros de medio completo por pozo en el cuarto día para limitar cualquier efecto de evaporación media.
Cuando los esferoides alcancen el tamaño experimental adecuado, angulo cuidadosamente la placa y utilice una pipeta multicanal para eliminar suavemente 150 microlitros de medio completo de cada pozo sin alterar los esferoides. A continuación, sustituya el medio desechado por 50 microlitros de una solución de uno a 200 de Annexin V Red y coloque la placa en una incubadora de cultivo celular durante 15 minutos. Centrífuga transdujo células T CAR CD19 en un tubo cónico de 15 mililitros y resuspend el pellet en dos mililitros de medio completo.
Después de contar, diluir las células a dos veces 10 a las quintas células por mililitro de concentración media completa. A continuación, agregue 100 microlitros de células T CAR CD19 a cada pozo que contenga esferoides y devuelva la placa al aparato de imágenes automatizado. En el software de adquisición, seleccione Programar para adquirir y haga clic con el botón derecho en la línea de tiempo del análisis.
Seleccione Editar línea de tiempo y haga clic con el botón derecho en el grupo de análisis para eliminarlo. Haga clic con el botón derecho en la línea de tiempo de nuevo y seleccione Establecer intervalo de grupo de análisis seleccionado y establezca Agregar exploraciones cada 1 1/2 horas y Para un total de 24 horas. A continuación, establezca la hora de inicio de la imagen en al menos una hora después del inicio de la incubación en el aparato de imágenes automatizado y seleccione Guardar escaneos de programación.
Para el análisis automatizado de imágenes, en el software de escaneo, seleccione Ver análisis recientes y Análisis de inicio. Seleccione Crear nueva definición de análisis y tipo de análisis Spheroid y establezca los canales de imagen que se analizarán. Seleccione al menos 10 imágenes representativas y obtenga una vista previa del procedimiento de análisis predeterminado en toda la pila de imágenes.
Modifique los parámetros de la máscara de campo brillante y previsualice la pila de imágenes, confirmando que los parámetros seleccionados detectan los esferoides con precisión. Modifique los parámetros de la máscara verde y previsualice la pila de imágenes para confirmar que los parámetros seleccionados detectan los esferoides con precisión. Modifique los parámetros de la máscara roja y previsualice la pila de imágenes para confirmar que los parámetros seleccionados detectan los esferoides con precisión.
Tenga cuidado de lograr la mejor señal sobre el ruido y la sensibilidad sobre las proporciones de especificidad, teniendo en cuenta que no será capaz de encontrar un conjunto de parámetros que permitirán capturar cada evento en cada momento. A continuación, inicie el analizador. Una vez completado el análisis, extraiga la medida de interés y seleccione el archivo analizado y la opción de métricas de gráficos.
Seleccione las métricas de interés, el análisis y el pozo. Haga clic en Exportar datos para extraer las métricas seleccionadas en varios formatos de archivo. A continuación, para extraer las imágenes, seleccione el archivo analizado y seleccione Exportar imágenes y películas.
La expresión CD19 CAR en células T transducidas y la expresión CD19 en células de cáncer colorrectal transducidas se pueden confirmar mediante citometría de flujo. Aquí, se puede observar el resultado de un experimento esferoide típico. A diferencia de las células T simuladas, las células T CD19 CAR son capaces de matar específicamente los esferoides derivados de la línea de células de cáncer colorrectal, disminuyendo en gran medida el número de células tumorales vivas.
El seguimiento de la evolución de las señales verdes y rojas totales dentro de los límites del esferoide con el tiempo revela que poco después de la inyección de células T CD19 CAR, el tamaño de los esferoides se reduce rápidamente a medida que la señal de apoptosis aumenta rápidamente. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como ensayos de toxicidad, ensayos de migración celular o mediciones de la estructura esferoides para responder preguntas adicionales sobre el cribado de fármacos, la motilidad de las células T o la formación de esferoides, respectivamente.
