Aquí, presentamos nuestro protocolo simple para la detección de inmunofluorescencia en proteínas en materiales seccionados. Este método no requiere recuperación de antígenos. Usaremos cabezas de ratón, incluyendo tejidos duros no descalificados.
La principal ventaja de esta técnica es omitir la recuperación y descalcificación de antígenos de los tejidos duros. Esos conducen a una buena calidad de los resultados de inmunosuchación. Este método también ahorra tiempo y mano de obra.
Este método también es aplicable a otros tejidos con modificaciones adecuadas. Para hacer secciones agradables a partir de tejidos no calcificados, diseccione aún más el tejido objetivo para recortar los tejidos circundantes y, si es necesario, tratar las muestras con 10%EDTA a cuatro grados centígrados durante dos días antes de la crioprotección. La demostración visual proporciona una explicación detallada y clara del procedimiento de este método.
Para empezar, prepare un plato de 10 centímetros y varios de 3,5 centímetros que contengan PBS y una placa de cultivo de 12 pozos que contenga dos mililitros de 4%PFA en PBS en cada pozo para cada ratón embarazada, y colóquelos todos en hielo. Para diseccionar embriones de ratones embarazadas, agarre la piel debajo del centro del vientre de un ratón eutanizado con fórceps, corte la piel solamente, y luego tire suavemente de la piel para separarla de la pared muscular abdominal subyacente. Siguiendo la misma línea de la incisión de la piel, corte en la cavidad abdominal.
Retire el útero que contiene una cadena de embriones. Luego, retire los embriones cortando suavemente la pared uterina, que eliminará los tejidos extramblariónónicos como el saco de yema y el amnion. Cortar y aislar la cabeza de cada embrión, y con fórceps transferir cada cabeza a un pozo separado de una placa de 12 pocillos que contiene 4%PFA.
Incubar a cuatro grados centígrados durante cuatro horas para arreglarlo. Enjuague las cabezas en PBS a cuatro grados centígrados con un suave temblor durante 12 horas. Para crioproteger las cabezas, transfiértalas con fórceps a una nueva placa de 12 pocillos que contenga dos mililitros de 30% de sacarosa en PBS.
Incubar con agitación suave a cuatro grados centígrados hasta que las cabezas se hundan hasta el fondo del plato. Para incrustar los cabezales crioprotegidos, transfiéralos a un molde que contenga un compuesto de temperatura de corte óptimo y equilibre durante varios minutos. Con fórceps, ajuste la ubicación y la dirección de las muestras para que el lado recortado de las muestras mire hacia la parte inferior del molde de incrustación.
Luego, coloque el molde sobre hielo seco para congelar, y guárdelo en una bolsa de plástico a menos 80 grados Celsius hasta que esté listo para la criocciones. Para el tejido postnatal, después de extraer la piel y los tejidos adiposos de un ratón eutanizado, de tres semanas a tres meses de edad, cortar y aislar la cabeza y extraer la mandíbula. Luego, fijar y crioproteger la cabeza como se hace con cabezas embrionarias.
Incrustar en 8%gelatina de una manera similar a los cabezas embrionarias en PTU, y mantener los Cryomolds en una bolsa de plástico a menos 80 grados Celsius hasta criosectación. Ajuste la temperatura del criostato adecuada. Coloque las muestras en la cámara del criostato durante unos 30 minutos para equilibrar a la temperatura del criostato.
Retire el bloque con la muestra del Cryomold, y móntelo con una caída OCT en el mandril de la muestra y congénelo, asegurándose de mantener el lado recortado de la muestra más alejado del mandril y mirando al operador. Cargue el mandril montado en bloque en el soporte del objeto criostato. Ajuste el soporte de la hoja de modo que el ángulo de la hoja sea de tres a cinco grados en relación con la muestra.
Recoger secciones de 10 micrómetros en diapositivas de microscopio recubiertas. Deje las secciones a temperatura ambiente hasta que estén completamente secas, y luego guárdelas a menos 80 grados centígrados. Para comenzar con la tinción, saque los portaobjetos de menos 80 grados Centígrados y manténgalos a temperatura ambiente durante una hora para secar al aire las secciones.
Enjuague los portaobjetos en 0.1%PBST tres veces durante cinco minutos cada uno para lavar los PTU y permeabilizar las secciones. Añadir 200 microlitros de solución de bloqueo a cada diapositiva e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, retire la solución de bloqueo sin enjuagar la diapositiva.
Añadir 100 microlitros de anticuerpo primario diluidos en solución de bloqueo a cada diapositiva, e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Enjuague los portaobjetos con PBS tres veces durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente. Añadir 100 microlitros de anticuerpos secundarios diluidos en solución de bloqueo e incubar durante una hora a temperatura ambiente, protegidos de la luz.
Enjuagar en PBS tres veces durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente, todavía protegido de la luz. Para montar las diapositivas, agregue dos gotas de medio anti-fade con DAPI en cada diapositiva, cubra con un cubreobjetos y almacene a cuatro grados Celsius hasta que esté listo para la imagen. Los huesos frontales de los embriones de control dieron positivo para pSmad1/5/9, factores de señalización BMP aguas abajo, y Ki67, un marcador de proliferación celular.
En embriones mutantes BMPR1A específicos de la cresta neural y activados constitutivamente, sin embargo, los niveles de pSmad1/5/9 se incrementaron mientras que los niveles de Ki67 disminuyeron. Además, se observaron más células apoptóticas en los huesos frontales de embriones mutantes que las de los embriones de control. Las criocciones coronales de las cabezas incrustadas en gelatina muestran claramente la señal GFP y la señal RFP de un casete tdTomato en el hueso nasal y los tejidos nasales, lo que demuestra que la gelatina no interfiere con las señales fluorescentes.
Cuando estas secciones fueron inmunotendidas para SOX9 u Osterix y E11/Podoplanina, se obtuvieron secciones de buena calidad de la mayoría de los tejidos duros de tres semanas. Por otro lado, con muestras de tres meses de edad, las secciones de buena calidad sólo se obtuvieron en algunos de los tejidos duros, incluyendo los compartimentos trabeculares del fémur, los tejidos nasales y el cráneo, incluyendo la sutura nasal-premaxilar y los huesos circundantes de la cabeza. Las células SOX9 positivas se detectaron específicamente en los condrocitos de la placa de crecimiento y la articulación del fémur y el tabique nasal.
En el incisivo de tres semanas de edad, SOX9 se detectó en las células mesenquimales. Los resultados de la doble tinción de Osterix y E11 muestran que Osterix se detectó en osteoblastos, mientras que E11 se detectó en los osteocitos de huesos del fémur y la cabeza. En el incisivo de tres semanas, Osterix fue positivo en odontoblastos, mientras que E11 fue positivo en células mesenquimales folículos.
Por favor, no sobrefije muestras con 4%PFA. Para el seccionamiento de tejidos duros no descalcificados en gelatina, la mejor temperatura es menos 25 grados Celsius y menor. Después de este procedimiento, los niveles de fluorescencia se pueden cuantificar como se describe en nuestro protocolo.
Estas mediciones proporcionarán datos informativos para mostrar la diferencia del nivel relativo de proteína entre diferentes grupos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para la tinción doble o triple para obtener patrones de coexpresión de diferentes proteínas. 4%PFA es peligroso.
Puede causar alergias cutáneas, daños oculares graves, daños en los órganos o cáncer. Utilice equipo de protección personal y lave bien la piel después de manipularla.
