Este protocolo describe una pantalla supresora simple y eficaz para identificar mutaciones supresoras en mutantes que tienen un defecto de crecimiento en la levadura de fisión. Los métodos tradicionales de mutagénesis utilizan sustancias químicas tóxicas o UV que pueden generar múltiples mutaciones en una célula. Por el contrario, este protocolo puede enriquecer un solo mutante supresor en células individuales sin usar métodos que inducen mutaciones.
Comience este procedimiento con la construcción y preparación de la deformación unitaria como se describe en el protocolo de texto. Agregue 200 microlitros de medios líquidos a cada pocódica de 96 pocillos. Con un aplicador estéril, tomar una pequeña cantidad de cada una de las colonias preparadas y suspender cada colonia en pozos individuales que contienen los medios líquidos.
Incluya un pozo en blanco para cada fila de la placa que contenga 200 microlitros del mismo medio. Ahora configure el protocolo en el software de detección del lector de placas conectado a un lector automático de microplacas. Ajuste la temperatura a 30 grados centígrados y establezca un programa cinético durante 24 horas con una frecuencia de lectura de dos minutos.
Esto da como resultado 721 lecturas totales durante un período de 24 horas por pozo. Ajuste el temblor a un temblor orbital rápido continuo. Ajuste las lecturas ópticas para medir la dispersión de la luz a una longitud de onda de 600 nanómetros para medir la densidad óptica y configurar la luz para leer desde debajo de la placa.
Después de 24 horas, registre las lecturas finales de densidad óptica en blanco y utilice la fórmula en el protocolo de texto para determinar el volumen necesario para diluir cada una de las muestras hasta una densidad óptica de 0.1. Para procesar por lotes el volumen de dilución que se utilizará desde cada pozo experimental, exporte los datos del software del lector de placas y utilice un software de hoja de cálculo para insertar la misma fórmula que una función. Cada 24 horas, utilice el mismo medio que el día cero para diluir cada una de las muestras a una densidad óptica de 0,1 utilizando la fórmula.
Asegúrese de utilizar la fórmula para diluir todos los pozos hasta una densidad óptica de 0.1. Esto incluye los pozos que pueden haber comenzado a mostrar cierta recuperación en su defecto de crecimiento. Guarde todas las curvas de crecimiento generadas diariamente.
Tenga en cuenta cualquier colonia individual que muestre una tasa de crecimiento aumentada juzgada por una densidad óptica final que es significativamente mayor que el resto de la cohorte con el mismo fondo genético o por una curva de crecimiento similar a la de las colonias de tipo salvaje. Este ensayo suele tardar entre siete y 14 días. Realice todos los pasos en condiciones estériles.
Desde el último día del ensayo del lector de placas, algunos cultivos líquidos tienen una tasa de crecimiento notablemente recuperada presumiblemente al obtener una mutación supresora que puede aliviar el fenotipo de la mutación parental. Para almacenar los cultivos fenotípicamente recuperados, transfiera y mezcle 250 microlitros de cultivo líquido a un criotubo que contenga 250 microlitros de 50% de glicerol. El flash congela las células en nitrógeno líquido y ahorra las cepas en menos 80 grados Celsius indefinidamente.
Para confirmar que la mutación supresora es un elemento genéticamente hereditaria, usa métodos de cruce genético estándar para cruzar tus células P mutantes favoritas con tus células S mutantes favoritas. Cuando dos células haploide con un tipo de apareamiento complementario se mezclan y se someten a inanición de nitrógeno, pueden generar un cigoto que esporula para formar un tetrad de cuatro esporas. Los materiales genéticos parentales se segregarán durante la meiosis siguiendo las reglas de la genética mendeliana.
Después de la esporulación, las esporas individuales de los mismos tetrados pueden diseccionarse y formar cuatro colonias individuales como se observa verticalmente en una placa. Coloque uniformemente las esporas una por una en la placa usando un microneedle. Después de la disección, deje que las células crezcan en una incubadora de 30 grados Celsius durante unos días hasta que aparezcan las colonias.
Si la mutación supresora es un elemento genéticamente hereditaria, esta cruz debe producir tetrads en los que dos colonias tienen el fenotipo de enfermedad de la cepa parental y dos colonias tienen la tasa de crecimiento de recuperación de la cepa supresora. Escoge tres colonias con el fenotipo supresor y tres colonias con el fenotipo parental de la misma cruz genética y procede con los pasos de extracción y secuenciación de ADN genómico como se detalla en el protocolo de texto. A continuación, realice un análisis bioinformático para la identificación de las mutaciones supresoras como se detalla en el texto.
Las curvas de crecimiento de las colonias individuales se registraron en el punto de tiempo inicial y durante seis días con monitoreo continuo utilizando el lector de placas. Como era de esperar, las colonias de tipo salvaje no muestran cambios notables en sus curvas de crecimiento a lo largo del experimento. En particular, cuatro colonias con el fondo de eliminación de elfo1 y una colonia de eliminación de fal1 muestran un cambio dramático en el crecimiento de crecimiento lento a algunos niveles variables de crecimiento similares a los de las colonias de tipo salvaje.
Dramáticamente, todos los mutantes clr6 muestran una recuperación fenotípica consistente que crece a un ritmo más rápido al final del ensayo. Dos de los cambios no sinónimos identificados, la mutación cue2 y la mutación rpl2702 fueron reconstruidos en el laboratorio utilizando protocolos estándar para la mutagénesis dirigida al sitio. Cue2 elf1 mutantes dobles y rpl2702 elf1 mutantes dobles fueron cruzados con la cepa mutante de eliminación elf1 de cortesía.
El cruce genético mostró que las mutaciones supresoras identificadas tienen éxito en la supresión del fenotipo de crecimiento lento del mutante de eliminación elf1 y son hereditarias. Durante la dilución diaria de la placa de 96 pocillos, es importante diluir todos los pozos a la misma concentración con el fin de evitar la recuperación de crecimiento artificial. Este método permite el aislamiento de mutaciones supresoras de una manera de alto rendimiento acelerando el descubrimiento de cientos de genes que no han sido bien caracterizados en levaduras de fisión y otros microorganismos.
Este método se puede utilizar para aislar a los supresores de todos los microorganismos que tienen mutación que causa defectos de crecimiento y que se pueden cultivar a una gran población en el cultivo líquido. La identificación de mutaciones supresoras en la levadura de fisión podría tener implicaciones potenciales en la búsqueda de genes causantes de enfermedades en vías superpuestas, especialmente cuando se trata de vías altamente conservadas de levadura a humanos.
