Este protocolo nos permite investigar los stents que eluyen drogas en un pequeño modelo animal de estenosis laringotraqueal que nos permite aprovechar a los animales modificados genéticamente de una manera rentable. La colocación transoral del stent de las vías respiratorias que eluyen a los fármacos evita a los animales una incisión abierta en la tráquea que representa un modelo más clínicamente relevante de estenosis laringotraqueal. Esta técnica facilita la investigación preclínica de las estrategias locales de administración de fármacos para tratar la estenosis laringotraqueal.
Esta técnica proporciona una plataforma factible y eficaz para la investigación traslacional de los stents de las vías respiratorias que eluyen fármacos en un modelo animal pequeño que se puede aplicar para la investigación futura en modelos animales más grandes, así como la aplicación clínica. técnica particularmente la intubación transoral, la inducción de la lesión de la tráquea, y el paso de colocación del stent de las vías respiratorias. La demostración visual de esta cirugía técnicamente desafiante es crítica, ya que muchos de los detalles finos no se pueden describir completamente con palabras.
Para hacer una solución de polímero 1%rapamicina que contenga, agregue seis miligramos de rapamicina a 600 miligramos de 70-30 PLLA-PCL-PCL en un vial de vidrio. Bajo una campana de humo, añadir seis mililitros de diclorometano al vial de rapamicina suplementado y controlar y añadir 120 microlitros de glicerol a cada vial. A continuación, tapice los viales y deje que la solución PLLA-PCL homogeneice durante seis a 12 horas a temperatura ambiente.
Para crear un stent de vías respiratorias murinos, utilizando materiales estériles y técnica, aplique un mililitro de solución PLLA-PCL suplementada con rapamicina suplementada sobre la cánula venosa de un angiocatéter a base de etileno propileno fluorado de calibre 22 mientras ralentiza la rotación del catéter. Cuando se haya aplicado toda la solución, propicie el angiocatéter moldeado con la punta del angiocatéter hacia abajo y la empuñadura del catéter en el borde de un plato petri de vidrio en una campana de vacío. Después de 24 horas bajo vacío a temperatura ambiente, gire suavemente y deslice el catéter de la construcción de stent seco y compruebe circunferencialmente el stent en busca de defectos que puedan haber resultado durante el proceso de fundición.
Para ayudar en la visualización, es útil dibujar una delgada línea negra a lo largo del stent. Recorte cada extremo de los stents fundidos con finas tijeras rectas para que los bordes sean axiales y utilice las tijeras para cortar cada ptent en segmentos axiales de tres milímetros. A continuación, cargue cada ptent de tres milímetros en un nuevo catéter venoso de calibre 22.
Para la inducción de la estenosis laringotraqueal, después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, coloque el primer ratón en una plataforma quirúrgica en la posición supina y coloque un pequeño trozo de hilo colocado en la parte superior de la plataforma alrededor de los incisivos centrales. Asegure las extremidades a la mesa con cinta adhesiva y haga una incisión vertical de 1,5 centímetros en el cuello del ratón. Divide el timo supero y lateraliza los dos lóbulos resultantes para visualizar la tráquea.
Divida los músculos esternoideoide y esternotiroides en el accesorio superior bilateralmente y pase un angiocatéter de calibre 22 transotéro a través de la laringe en la tráquea. Con pequeños fórceps, aplique presión sobre la laringe anterior del ratón para ayudar en la colocación correcta del catéter. Un angiocatéter colocado correctamente puede visualizarse por su color blanco a través de la tráquea.
Para inducir la lesión, pase un cepillo de alambre recubierto de Bleomicina a través del angiocatéter insertado y retire lentamente el catéter de modo que sólo quede el cepillo de alambre dentro de la tráquea. Usando fórceps finos, aplique contrapresión en la tráquea para interrumpir mecánicamente el lumen traqueal con el cepillo antes de reinsertar el catéter en la tráquea sobre el cepillo. Retire el cepillo de alambre y vuelva a aplicar la Bleomycin antes de insertar y quitar el cepillo cuatro veces más como se acaba de demostrar.
Después de la última aplicación de Bleomycin, retire el catéter de la tráquea. Para la colocación transoral de un PLLA-PCL, asegúrese de que se ha incorporado una delgada línea vertical negra en cada stent e intuba el ratón transoralmente con el angiocatéter precargado. El stent debe visualizarse dentro de la tráquea a través de la incisión transcervical.
Cuando el stent esté en su lugar, utilice fórceps finos para agarrar firmemente pero suavemente la tráquea a través de la incisión para mantener el stent en su lugar y retirar el catéter. Es fundamental colocar el stent con el cuidado posible. Demasiada presión sobre la tráquea resultará en el colapso del stent causando obstrucción de las vías respiratorias y la muerte al animal.
Cierre la incisión con pegamento tisú o suturas cromáticos 4-0 absorbibles utilizadas aquí y permita que el ratón se recupere con monitoreo antes de devolver al animal a su jaula de origen. En el punto final experimental apropiado, coloque el ratón de interés en la posición supina en la plataforma quirúrgica y utilice tijeras de iris curvadas finas para reabrir la incisión. Exponga la tráquea como se ha demostrado y utilice las tijeras para dividir la tráquea distal por debajo del nivel del stent.
A continuación, divida la tráquea proximal por debajo de la laringe y por encima del stent y separe la tráquea dividida del esófago posteriormente. A continuación, retire el stent de la tráquea y fije la tráquea en 10% de formalina durante 24 horas. La construcción de stent PLLA-PCL cargada de rapamicina biodegradable utilizada en este estudio es capaz de eluirse a la rapamicina de una manera consistente y predecible en condiciones fisiológicas.
En esta imagen, el stent biocompatible miniaturizado se puede observar in situ dentro de la tráquea como lo indica el marcador negro en el stent visualizado a través de la tráquea de ratón translúcido. Después de 21 días, el marcador de tinte negro se puede utilizar para confirmar el mantenimiento de la posición del stent dentro de la tráquea. Las pruebas de biocompatibilidad con tinción inmunofluorescente para marcadores de inflamación aguda y crónica demuestran que la construcción del stent PLLA-PCL no es inmunorreactiva según lo determinado por el número mínimo de células inmunitarias presentes después de la colocación en ausencia de lesión.
Manipular las vías respiratorias de una manera delicada y atraumática es fundamental para el éxito del procedimiento. La fuerza excesiva, las intubaciones múltiples y el colapso del stent pueden conducir a la muerte de los animales. Después del tratamiento con stent de rapamicina, se puede realizar la evaluación de la supervivencia, la expresión génica a través de PCR cuantitativa en tiempo real, inmunoensayo que incluye citometría de flujo, ELISA e inmunohistoquímica.
Como proporciona una plataforma exitosa para la elución de drogas en un modelo de ratón, esta técnica allana el camino para futuras investigaciones de terapias aplicadas localmente en estenosis laringotraqueal. El diclorometano es un líquido corrosivo. Asegúrese de usar siempre una campana de humos, equipo de protección personal y materiales no corrosivos
