Este protocolo permite el cultivo in vitro y la visualización microscópica directa de los tejidos aislados de las vías respiratorias durante diferentes procedimientos de manipulación tisular, como la desepitelización y la regeneración del tejido de las vías respiratorias. La imagen in situ propuesta en este estudio permite un monitoreo rápido y no destructivo de la luz traqueal durante la eliminación controlada guiada por imágenes del epitelio endógeno y la entrega de las células exógenas. La plataforma biorreactiva guiada por imágenes y los protocolos de manipulación de tejidos se pueden utilizar para generar tejido de las vías respiratorias de bioingeniería para el modelado de enfermedades y la detección de fármacos.
La construcción y el uso del biorreactor de tejido de las vías respiratorias habilitado para imágenes serán demostrados por dos estudiantes de doctorado de nuestro grupo de investigación, Mohammad Mir y Jiawen Chen. Para comenzar a crear un dispositivo de imágenes in situ, inserte una lente de tubo en un tubo de lente apilable y asegúrela con un anillo de retención. A continuación, monte el conjunto de la mesa de lentes en una cámara CMOS científica a través de un adaptador de montura C.
Utilice el software Micromanager para operar la cámara y adquirir fotos y videos. Mientras apunta a un objeto ubicado a 10 metros de la cámara, ajuste la distancia entre la lente del tubo y el sensor de imagen de la cámara hasta que se forme una imagen enfocada del objeto en la pantalla de la computadora. A continuación, use componentes del sistema de jaula óptica, como la varilla de ensamblaje, la placa de jaula roscada y el cubo de jaula para montar una lente de filtro en un espejo dicroico de doble borde, superresolución y un láser para el dispositivo.
Conecte una lente de objetivo 20X al dispositivo. Luego, monte una lente verde con un diámetro de 500 micrómetros en el extremo distal del tubo de la lente a través del traductor X-Y. Ajuste la distancia entre las lentes verdes y las del objetivo para formar las imágenes microscópicas enfocadas.
Para visualizar la luz aislada de la tráquea de la rata en campo brillante o fluorescente, coloque el biorreactor en la etapa de imagen. A continuación, infunda 500 microlitros del éster de succinimidil carboxifluoresceína recién preparado, o solución CFSE, a un caudal de cinco mililitros por minuto a través de la tráquea a través de la bomba de jeringa conectada al tubo de la cánula de la tráquea. Una vez que la solución CFSE llene la tráquea, detenga la bomba.
Después de 10 minutos, lave la luz de la tráquea infundiendo 10 mililitros de PBS usando la bomba de jeringa para eliminar los reactivos CFSE residuales no incorporados. Después del lavado, inserte el extremo de imagen distal de la lente verde en la tráquea a través del conector luer conectado a un extremo de la tráquea. Luego, mueva suavemente la lente verde dentro de la tráquea hasta que la superficie de la tráquea esté enfocada.
Para capturar las imágenes de campo brillante en el software micromanager, ilumine la luz de la tráquea con luz blanca a través del cubo de la jaula. Luego, haga clic en el icono Live para mostrar la superficie lumenal de la tráquea en tiempo real. Utilice la configuración de imágenes y las fichas Exposición para cambiar el tiempo de exposición al valor deseado.
Para ajustar el contraste y el brillo de las imágenes, utilice la ventana de escalado de histograma e intensidad para mover las flechas en blanco y negro en el punto final de la pantalla interactiva del histograma. Haga clic en Detener activación para activar el icono Snap y, a continuación, haga clic en el icono Snap para congelar la imagen. A continuación, use la configuración Exportar y luego las pestañas Imágenes como desplazadas para guardar las imágenes en el formato deseado.
Para obtener fotos y videos en modo fluorescente, ilumine la luz de la tráquea con luz láser específica de CFSE a través del cubo de la jaula y adquiera las imágenes en tiempo real moviendo la sonda de imágenes hacia adelante y hacia atrás. Una vez que se obtengan las fotos y los videos, retire suavemente la lente verde de la tráquea. Para la desepitelización de la tráquea, instile 50 microlitros del dodecil sulfato de sodio recién preparado al 2% a través de la cánula de la tráquea para generar una película delgada de la solución detergente en la luz de la tráquea.
Después de la instilación, cierre las conexiones de los tubos del biorreactor con tapones luer machos o hembras y transfiera el biorreactor a una incubadora de 37 grados Celsius durante 10 minutos para permitir que el SDS habite dentro de la tráquea. Repita la instilación una vez. Después de la segunda instilación, retire el epitelio lisado y la SDS regando la luz de la tráquea tres veces con 500 microlitros de PBS a través de una bomba de jeringa a una velocidad de flujo de 10 mililitros por minuto.
Luego, coloque el biorreactor en un agitador para vibrar mecánicamente a una frecuencia de 20 Hertz y una amplitud de desplazamiento de 0,3 milímetros para promover físicamente el desprendimiento de las células epiteliales tratadas con SDS de la luz de la tráquea. Mientras la tráquea vibra mecánicamente, instila 500 microlitros de PBS dos veces a través de la luz de la tráquea para eliminar el SDS residual y los desechos celulares. Después de la eliminación del epitelio, evalúe el aclaramiento de la capa epitelial midiendo la intensidad del CFSE utilizando el dispositivo de imágenes de lente verde.
Después de preparar una tráquea de rata deseptelizada, descongele las células madre mesenquimales congeladas, o MSC, durante 30 segundos en un baño de agua de 37 grados centígrados. Luego, cuente las células con un hemocitómetro, seguido de preparar una solución celular con una concentración de cinco veces 10 a las seis células por mililitro. Luego, etiquete las células fluorescentemente incubándolas con dos mililitros de solución CFSE de 100 micromolares a temperatura ambiente.
Después de 15 minutos, enjuague las células con cinco mililitros de PBS tres veces antes de volver a depositarlas en un medio de cultivo DMEM fresco a una concentración final de tres veces 10 a las siete células por mililitro. Inmediatamente después de la preparación del hidrogel de colágeno I, como se describe en el manuscrito, agregue las células a la solución de hidrogel con la concentración deseada. Luego, mezcle las células y la solución de gel con una micropipeta para obtener una mezcla uniforme de célula e hidrogel.
A continuación, conecte un extremo de la tráquea dentro del biorreactor a una bomba de jeringa programable a través de un conector luer y entregue cinco mililitros de medio de cultivo fresco en la cámara del biorreactor a 37 grados Celsius para cubrir la superficie exterior de la tráquea. Luego, administre 10 bolos de microlitros de la mezcla de célula e hidrogel en la tráquea desepitelizada dentro del biorreactor para generar una capa de célula e hidrogel en la luz de la tráquea. Después de la inyección celular, coloque el biorreactor en una incubadora de cultivo celular estéril a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono para la gotellación durante 30 minutos para permitir la gotellación.
Para visualizar la distribución de las células implantadas, esterilize la lente verde con alcohol isopropílico o etanol al 70% y coloque el biorreactor en el escenario de imágenes para obtener las fotos y videos en los modos de campo brillante y fluorescente. Después de 30 minutos de siembra celular, infundir un mililitro de medio de cultivo en la luz de la tráquea a una velocidad de flujo de un mililitro por minuto. Finalmente, cultive la tráquea con semilla celular dentro del biorreactor en una incubadora a 37 grados centígrados durante el tiempo deseado.
Durante el cultivo celular, mantenga los medios dentro de la luz estáticos, mientras que los medios fuera de la tráquea se perfunden continuamente a través de un flujo unidireccional. En las imágenes fluorescentes y de campo brillante de la tráquea desepitelizada, no se observó ninguna señal fluorescente antes del etiquetado CFSE. Con el CFSE, se observó una señal fluorescente uniforme en todo el epitelio.
Después de la desepitelización, la intensidad fluorescente disminuyó significativamente, lo que indica la ablación del epitelio. La tinción de hematoxilina y eosina de la tráquea desepitelizada ilustró la eliminación del epitelio pseudoestratificado de la luz de la tráquea, y la preservación de las células y la matriz extracelular, o microestructuras ECM, en las capas de tejido subyacentes. Además, la tinción de pentacromo y tricromo confirmó el mantenimiento de la arquitectura del tejido de la tráquea y los componentes de ECM, como el colágeno y los proteoglicanos.
La inmunofluorescencia de las células epiteliales y el colágeno I reveló la eliminación completa del epitelio y la preservación del colágeno I dentro del tejido subepitelial. Las micrografías electrónicas de barrido indicaron que la tráquea nativa estaba poblada de células multiciliadas y caliciformes. En la tráquea desepitelizada, la membrana basal quedó expuesta, como lo indica una red de malla de fibras de matriz extracelular y la ausencia de células epiteliales.
Las imágenes de fluorescencia de la tráquea desepitelizada, al sembrar con PBS y colágeno, se muestran aquí. En comparación con las células sembradas a través de un medio de cultivo, las células marcadas fluorescentemente administradas a través de hidrogel permanecieron adheridas de manera más uniforme a través de la luz. El estudio de viabilidad celular demostró que la viabilidad no se vio afectada por el procedimiento de administración celular, y más del 90% de las células permanecieron viables.
La creación de una película delgada de detergente en el proceso de desepitelización y el uso de hidrogel como vehículo de entrega para las células son pasos esenciales para el éxito de este protocolo. Nuestro próximo objetivo de investigación es implantar células primarias o madre de las vías respiratorias cultivadas en laboratorio en el tejido de las vías respiratorias desepitelizado para investigar si se puede preparar tejido funcional de las vías respiratorias.
