Este método demuestra la calibración de la cantidad de proteína cuantificadora en muestra líquida con proceso de una sola molécula para el recuento. Específicamente, puede ilustrar cómo las poblaciones de proteínas se pueden etiquetar fluorescentemente en cada nivel de molécula. Los métodos anteriores realizaron mediciones a granel para analizar las proporciones molares de moléculas fluorescentes y de proteínas, pero no pueden revelar cómo las poblaciones de proteínas heterogéneamente están realmente etiquetadas.
Nuestros métodos pueden hacerlo directamente a nivel de una sola molécula. Nuestro método puede extenderse hacia ensayos de concentración molecular ultrasensibles y avanzados, lo que conducirá a futuros métodos de diagnóstico, permitiendo hallazgos eficientes de moléculas patógenas en muestras. Nuestro método se puede aplicar al análisis de especies de una sola proteína utilizando anticuerpos fluorescentes, así como a múltiples análisis de especies utilizando etiquetas no específicas para todas las proteínas separadas por electroforesis o cromatografía.
El punto más crítico de la técnica es obtener reproducibilidad de datos. Recomiendo mantener la misma condición experimental tanto como sea posible al medir varias muestras. La demostración visual de esta técnica proporcionará cómo hacer que cada paso experimental sea estable y reproducible.
También mostrará algunos pasos poco comunes en los protocolos de bioquímica, como el recubrimiento de espín y el lavado de cubreobjetos de microscopio. Para comenzar este procedimiento, prepare el búfer de lising y el 1%Tween-20 como se describe en el protocolo de texto. Utilice hidróxido de sodio para ajustar el pH a 12.
Mezclar 100 microlitros de tampón de celo con un microlitro de un DDT molar y cuatro microlitros de 50%CHAPS. Agregue un microlitros del cultivo celular preparado y homogeneice la solución pipeteando lentamente para evitar burbujas. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante cinco minutos con agitación suave.
A continuación, vuelva a homogeneizar la solución pipeteándola lentamente hacia arriba y hacia abajo. Agregue un microgramo de tinte éster Cy3 NHS y homogeneice la solución ralentizando el pipeteo para evitar burbujas. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación suave.
Repita este proceso, añadiendo la misma cantidad de tinte e incubando la muestra una vez. Añadir 100 microlitros de 0,8 molares de hidróxido de sodio HEPES para ajustar el pH de la solución a 7.2 y apagar la reacción. Pipetear lentamente hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar la solución.
A continuación, agregue 20 microlitros de Biotina-2-amina y cinco microlitros de EDC. Homogeneizar la solución pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante una hora con agitación suave.
Después de esto, utilice una columna de ultrafiltración con un límite de 10 kiloDalton para eliminar cualquier reactivo de etiquetado no reaccionado y concentrar la muestra. Después de realizar SDS-PAGE estándar para la muestra de proteína y una escalera molecular, imagine el gel para identificar la ubicación de las bandas de proteínas. Usa una cuchilla afilada para cortar las porciones de gel que incluyen fracciones proteicas de interés basadas en la ubicación de las bandas.
En primer lugar, establecer los cubreobjetos que son 22 milímetros por 22 milímetros y son 0.15 milímetros de espesor. Utilice un limpiador de plasma para exponer los cubreobjetos al plasma de aire durante un minuto para limpiar y activar sus superficies. A continuación, utilice una recubridora de centrifugado para hilar la capa de los cubreobjetos con 200 microlitros de tampón de avadina durante cinco segundos a 500 RPM, seguido de 30 segundos a 1000 RPM.
Incubar los cubreobjetos a temperatura ambiente durante 15 minutos para dejar que se sequen al aire. Para preparar los cubreobjetos para la muestra de proteína, utilice una muestra de proteína que se haya diluido. Coloque 100 microlitros de la muestra diluida en el centro de los cubreobjetos recubiertos de avadina.
Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos. Para preparar el control positivo, coloque 100 microlitros de biotina fluorescente purificada en cinco micromolares HIDróxido de sodio HEPES a pH 7.2 en el centro de un cubreobjeto recubierto de avadina. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Para preparar el control negativo, espínesa cubre los cubreobjetos de plasma con 200 microlitros de cinco hidróxido de sodio HEPES con dos miligramos por mililitro de BSA sin avadina. Añadir 100 microlitros a la biotina fluorescente purificada en cinco micromolares HEPES-hidróxido de sodio a pH 7.2. Incubar en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Después de esto, enjuague cada cubreobjetos con 200 microlitros de agua destilada pipeteando en los bordes, asegurándose de no tocar el centro del cubreobjetos con la punta de la pipeta. Repita este lavado tres veces. Luego, exponga un número igual de cubreobjetos nuevos al plasma de aire durante un minuto.
Coloque un cubreobjetos limpio encima de cada cubreobjetos ligado a la muestra para evitar el secado. Poner en marcha un microscopio de fluorescencia de campo ancho o evanescente. Ponga un cubreobjetos en el microscopio y encuentre el foco.
A continuación, realice un análisis de mosaico para obtener al menos 100 imágenes. En este estudio, la homogeneidad de etiquetado de cada especie de proteína etiquetada en las células se cuantifica después de la separación con SDS-PAGE. Los datos de imagen bruta para diferentes fracciones de peso molecular de proteínas del lysate celular de HeLa, así como los controles positivos y negativos, se ven aquí.
Mientras que tanto la muestra de proteína como el control positivo exhiben entre 100 y 500 puntos por imagen, el control negativo exhibe muy pocos o ninguno. Esto demuestra que el proceso inhibe suficientemente la unión no específica de los tintes a la superficie del cubreobjetos. Los histogramas de intensidad puntual de las muestras de proteínas y el control positivo presentan múltiples picos, que representan la unión estocástica de los tintes a las aminas primarias en proteínas y estructuras de tetraméricos de avadina respectivamente.
Todas las manchas mostraron parpadeo y fotoblancada escalonada con excitación láser continua, resaltando la observación a nivel de molécula única. La ocupación del etiquetado, o LO, se calcula a continuación a partir de la relación entre el número de puntos de cada muestra de proteína y el del control positivo. La LO medida a partir de la muestra de izado celular de HeLa oscila entre el 50% para la fracción de peso molecular más pequeño, hasta el 90% para la fracción de peso molecular más alto.
La LO para toda la muestra de proteome sin separación se considera 72%Es fundamental utilizar reactivos recién hechos y evitar cualquier polvo, especialmente durante la preparación de los cubreobjetos. Después de este procedimiento, se puede realizar un análisis de recuento de moléculas individuales en un determinado volumen para cuantificar las concentraciones de cada proteína. Por ejemplo, se puede realizar un análisis de cualquier producto crudo, o productos de electroforesis de gel y capilar.
Esta técnica allana el camino para utilizar imágenes de fluorescencia de molécula única a medicina molecular, química orgánica y análisis omics. Al salvar el concepto entre la concentración y los números. El hidróxido de sodio concentrado es corrosivo, y se debe usar una protección adecuada al manipularlo.
Además, la radiación láser de alta potencia puede causar daño ocular, por lo que se pueden usar gafas protectoras.
