Este protocolo detalla el uso de un dispositivo de posicionamiento para la entrega intranasal de biomoléculas al CNS del ratón. El uso de este dispositivo reduce significativamente el manejo de ratones y el tiempo de tratamiento, lo que resulta en una mayor eficiencia y reproducibilidad de la técnica. Para comenzar este procedimiento, evalúe el nivel de anestesia de los ratones por reflejo de pedal con el fin de mantener el plano quirúrgico.
A continuación, coloque el dispositivo de posicionamiento a una distancia y altura adecuadas para permitir un acceso conveniente a todos los reactivos necesarios. Luego, aplica un pomada en los ojos del animal. Correa de un ratón con cinturones de silla, asegurándose de que las extremidades delanteras del ratón proporcionan apoyo natural mientras está en una posición relajada sin ninguna molestia.
Repita los procedimientos para los ratones restantes. Coloque suavemente cada ratón en la silla designada colocando su parte posterior paralela al soporte de la silla y a 90 grados hasta el asiento de la silla. Deje que el animal se acueste naturalmente en la cabeza hacia abajo y hacia adelante sin empujar o presionar.
Una vez que todos los ratones están atados, comience inmediatamente la inoculación intranasal. Para realizar la entrega intranasal, cargue la micropipeta con dos microlitros de solución compleja de SIRNA RVG9R. Sostenga la pipeta en la mano dominante y sosténjes con la otra mano para evitar movimientos incontrolados mientras se administra el ARSNr.
Coloque alrededor de una gota de dos microlitros muy cerca de una fosa nasal para que el ratón pueda inhalarla directamente. Si no se forma fácilmente una pequeña gota, sustituya la punta de la pipeta por una nueva y repita la operación. Empuje suavemente la cabeza del ratón hacia abajo con el dedo índice durante cinco segundos mientras está inhalando y manteniendo la posición.
Para evitar el drenaje de la droga en los pulmones es importante empujar con sed la cabeza del ratón hacia abajo con el dedo índice durante cinco segundos mientras el ratón está inhalando. Comience un cronómetro para cronometr de tres a cuatro minutos después de esto para cronocular la inoculación en la segunda nare del primer ratón. Este intervalo de tiempo es necesario para que el ratón complete la inhalación de la primera dosis y restaure la respiración normal.
En el intervalo de tres a cuatro minutos entre la inoculación de narinas alternativas en el primer ratón, inoculación intranasal completa de una nare en cada uno de los tres ratones restantes colocados en el dispositivo. Cuando suene el cronómetro, inocular la segunda fosa nasal en el primer ratón y repetir el procedimiento para los otros ratones como arriba. Repita el procedimiento hasta que se administren los 20 a 30 microlitros para los cuatro ratones.
Tardará entre 30 y 45 minutos en completar todo el procedimiento de inoculación. Devolver a los animales a sus jaulas designadas. No deje a los ratones desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la recumbencia esternal.
Para evaluar el silenciamiento de genes, extraiga el ARN de varias regiones cerebrales con un kit de purificación de ARN, revierta la transcripción en ADNc utilizando un kit de síntesis de ADNc y realice qPCR con pares de imprimación. La mayor parte de la entrega cerebral del péptido RVG9R etiquetado con Alexa Fluor 488 se probó por primera vez mediante el uso del dispositivo de posicionamiento del ratón descrito aquí. A las 48 horas después de la inoculación, varios órganos fueron extirpados para medir la fluorescencia A488.
No se detectó nada en ninguno de los órganos de los controles negativos. Por otro lado, una fuerte señal fluorescente A488 fue detectada exclusivamente en los cerebros del grupo inoculado RVG9R. Además, la posición de colocación del ratón se comparó con el método de posición supina y el método despierto para la eficacia.
Los resultados indicaron que la colocación de los ratones cabeza hacia abajo y hacia adelante mejoró la penetración y la deposición de RVG9R A488 en todo el tejido cerebral. Para confirmar aún más la administración de siRNA al cerebro, se realizó una exploración cerebral completa después de una sola administración intranasal de RVG9R complejada a SiRNA etiquetada cy5. A diferencia de PBS o RVM9R, complejo con RVG9R resultó en una fuerte acumulación de ar ARNs en las principales regiones cerebrales, incluyendo la bombilla olfativa, la corteza, el hipocampo, el tálamo, el hipotálamo, el cerebro medio y el cerebelo.
El dispositivo de posicionamiento se puede utilizar para la entrega de fármacos o moléculas al SNC del ratón. Las aplicaciones se extienden a las pruebas de terapia, así como al examen de los mecanismos celulares en el SNC. Este dispositivo de posicionamiento ha sido utilizado por los investigadores para demostrar la potencia de los siRNAs en el tratamiento de la enfermedad por el virus del Nilo Occidental, así como para explorar terapias para otras enfermedades del SNC.
