Este protocolo detalha o uso de um dispositivo de posicionamento para a entrega intranasal de biomoléculas ao CNS do mouse. O uso deste dispositivo reduz significativamente o manuseio de camundongos e o tempo de tratamento, resultando em melhores eficiências e reprodutibilidade da técnica. Para iniciar este procedimento, avalie o nível de anestesia dos camundongos pelo reflexo do pedal para manter o plano cirúrgico.
Em seguida, coloque o dispositivo de posicionamento a uma distância e altura adequadas para permitir acesso conveniente a todos os reagentes necessários. Em seguida, aplique pomada nos olhos do animal. Amarre um mouse com cintos de cadeira, certificando-se de que os membros dianteiros do mouse forneçam suporte natural enquanto ele estiver em uma posição relaxada sem qualquer desconforto.
Repita os procedimentos para os ratos restantes. Coloque suavemente cada rato na cadeira designada, colocando suas costas paralelas ao apoio traseiro da cadeira e a 90 graus no assento da cadeira. Deixe o animal deitar naturalmente na cabeça para baixo e para a frente posição sem empurrar ou pressionar.
Uma vez que todos os ratos estejam amarrados, inicie imediatamente a inoculação intranasal. Para realizar a entrega intranasal, carregue o micropipette com dois microliters de solução complexa siRNA RVG9R. Segure a pipeta na mão dominante e apoie-a com a outra mão para evitar movimentos descontrolados durante a administração do siRNA.
Coloque cerca de duas gotículas de microliter muito perto de uma narina para que o mouse possa inalá-la diretamente. Se uma pequena gota não for facilmente formada, substitua a ponta da pipeta por uma nova e repita a operação. Empurre suavemente a cabeça do mouse para baixo com o dedo indicador por cinco segundos enquanto ele está inalando e mantendo a posição.
Para evitar a drenagem da droga nos pulmões é importante empurrar sedadamente a cabeça do rato para baixo com o dedo indicador por cinco segundos enquanto o rato está inalando. Inicie um cronômetro para marcar de três a quatro minutos depois disso para cronometrar a inoculação na segunda nare do primeiro mouse. Este intervalo de tempo é necessário para que o rato complete a inalação da primeira dose e restaure a respiração normal.
No intervalo de três a quatro minutos entre a inoculação de nares alternadas no primeiro rato, inoculação intranasal completa de um nare em cada um dos três ratos restantes colocados no dispositivo. Quando o cronômetro soar, inocular a segunda narina no primeiro mouse e repetir o procedimento para os outros ratos como acima. Repita o procedimento até que os 20 a 30 microliters sejam entregues para todos os quatro camundongos.
Levará cerca de 30 a 45 minutos para completar todo o procedimento de inoculação. Devolva os animais de volta às suas gaiolas designadas. Não deixe os camundongos sozinhos até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter a recumbência severa.
Para avaliar o silenciamento genético, extrair RNA de várias regiões cerebrais com um kit de purificação de RNA, transcrição reversa em cDNA usando um kit de síntese cDNA e executar qPCR com pares de primer. A maioria da entrega cerebral do peptídeo RVG9R rotulado com Alexa Fluor 488 foi testada pela primeira vez usando o dispositivo de posicionamento do mouse descrito aqui. Em 48 horas após a inoculação, vários órgãos foram extirpados para medir a fluorescência A488.
Nada foi detectado em nenhum dos órgãos nos controles negativos. Por outro lado, um forte sinal fluorescente A488 foi detectado exclusivamente no cérebro do grupo inoculado RVG9R. Além disso, a posição de colocação do mouse foi comparada com o método de posição supina e o método acordado para eficácia.
Os resultados indicaram que o posicionamento dos camundongos de cabeça para baixo e para frente melhorou a penetração e a deposição do RVG9R A488 em todo o tecido cerebral. Para confirmar ainda mais a entrega do siRNA ao cérebro, o escaneamento cerebral completo foi realizado após uma única administração intranasal de RVG9R complexa ao siRNA rotulado Cy5. Em contraste com PBS ou RVM9R, o complexo com o RVG9R resultou em um forte acúmulo de siRNA nas principais regiões cerebrais, incluindo a lâmpada olfativa, o córtex, o hipocampo, o tálamo, o hipotálamo, o cérebro médio e o cerebelo.
O dispositivo de posicionamento pode ser usado para a entrega de drogas ou moléculas ao mouse CNS. As aplicações se estendem ao teste de terapêutica, bem como ao exame de mecanismos celulares no CNS. Este dispositivo de posicionamento tem sido usado pelos pesquisadores para demonstrar a potência das siRNAs no tratamento da doença do Vírus do Nilo Ocidental, bem como explorar terapias para outras doenças do SNC.
