Questo protocollo descrive in dettaglio l'uso di un dispositivo di posizionamento per la consegna intranasale di biomolecole al SNC del mouse. L'uso di questo dispositivo riduce significativamente la manipolazione dei topi e il tempo di trattamento con conseguente miglioramento dell'efficienza e della riproducibilità della tecnica. Per iniziare questa procedura, valutare il livello di anestesia dei topi per riflesso del pedale al fine di mantenere il piano chirurgico.
Quindi, posizionare il dispositivo di posizionamento a una distanza e un'altezza appropriate per consentire un comodo accesso a tutti i reagenti richiesti. Quindi, applicare un unguento sugli occhi dell'animale. Allaccia un mouse con cinture per sedie, assicurandoti che gli arti anteriori del mouse forniscano un supporto naturale mentre è in una posizione rilassata senza alcun disagio.
Ripetere le procedure per i topi rimanenti. Posizionare delicatamente ogni mouse sulla sedia designata appoggiando lo schienale parallelo al supporto posteriore della sedia e a 90 gradi dal sedile della sedia. Lascia che l'animale giace naturalmente nella testa in posizione verso il basso e in avanti senza spingere o premere.
Una volta che tutti i topi sono legati, iniziare immediatamente l'inoculazione intranasale. Per eseguire l'erogazione intranasale, caricare la micropipetta con due microlitri di soluzione complessa di siRNA RVG9R. Tenere la pipetta nella mano dominante e sostenerla con l'altra mano per evitare movimenti incontrollati durante la somministrazione di siRNA.
Posizionare circa una goccia a due microliter molto vicino a una narice in modo che il mouse possa inalare direttamente. Se una piccola goccia non è facilmente formabile, sostituire la punta della pipetta con una nuova e ripetere l'operazione. Spingere delicatamente la testa del mouse verso il basso con l'indice per cinque secondi mentre inala e mantiene la posizione.
Per prevenire il drenaggio del farmaco nei polmoni è importante spingere sedatamente la testa del mouse verso il basso con l'indice per cinque secondi mentre il mouse sta inalando. Inizia un cronometro per cronometrare da tre a quattro minuti dopo questa inoculazione del tempo nel secondo rullante del primo mouse. Questo intervallo di tempo è necessario affinché il mouse completi l'inalazione della prima dose e ripristini la respirazione normale.
Nell'intervallo da tre a quattro minuti tra l'inoculazione di nari alternativi sul primo mouse, l'inoculazione intranasale completa di un rullante in ciascuno dei restanti tre topi posti sul dispositivo. Quando il cronometro suona, inoculare la seconda narice sul primo mouse e ripetere la procedura per gli altri topi come sopra. Ripetere la procedura fino a quando i 20-30 microlitri vengono consegnati per tutti e quattro i topi.
Ci ranno dai 30 ai 45 minuti per completare l'intera procedura di inoculazione. Riporta gli animali nelle loro gabbie designate. Non lasciare i topi incustoditi fino a quando non hanno ripreso sufficiente coscienza per mantenere la reclinanza sternale.
Per valutare il silenziamento genico, estrarre l'RNA da varie regioni cerebrali con un kit di purificazione dell'RNA, invertire la trascrizione in cDNA usando un kit di sintesi cDNA ed eseguire qPCR con coppie di primer. La maggior parte della consegna cerebrale del peptide RVG9R etichettato con Alexa Fluor 488 è stata testata per la prima volta utilizzando il dispositivo di posizionamento del mouse descritto qui. A 48 ore dall'inoculazione, vari organi sono stati asportati per misurare la fluorescenza A488.
Nulla è stato rilevato in nessuno degli organi nei controlli negativi. D'altra parte, un forte segnale fluorescente A488 è stato rilevato esclusivamente nel cervello del gruppo inoculato RVG9R. Inoltre, la posizione di posizionamento del mouse è stata confrontata con il metodo di posizione supina e il metodo awake per l'efficacia.
I risultati hanno indicato che il posizionamento dei topi a testa in giù e in avanti ha migliorato la penetranza e la deposizione di RVG9R A488 in tutto il tessuto cerebrale. Per confermare ulteriormente la consegna di siRNA al cervello, è stata eseguita una scansione cerebrale completa dopo una singola somministrazione intranasale di RVG9R complessa a SiRNA etichettato Cy5. In contrasto con PBS o RVM9R, la complessità con RVG9R ha portato a un forte accumulo di siRNA nelle principali regioni cerebrali tra cui il bulbo olfattivo, la corteccia, l'ippocampo, il talamo, l'ipotalamo, il cervello medio e il cervelletto.
Il dispositivo di posizionamento può essere utilizzato per la consegna di farmaci o molecole al SNC del topo. Le applicazioni si estendono al test delle terapie e all'esame dei meccanismi cellulari nel SNC. Questo dispositivo di posizionamento è stato utilizzato dagli investigatori per dimostrare la potenza dei siRNA nel trattamento della malattia del virus del Nilo occidentale, nonché per esplorare terapie per altre malattie del SNC.
