このプロトコルは、マウスCNSへの生体分子の鼻腔内送達のための測位装置の使用を詳述する。この装置の使用は、マウスの取り扱いと治療時間を大幅に削減し、技術の効率と再現性を向上させます。この手順を開始するには、手術面を維持するためにペダル反射によりマウスの麻酔レベルを評価する。
次に、適切な距離と高さで位置決め装置を配置し、必要なすべての試薬に便利にアクセスできるようにします。その後、動物の目に軟膏を塗布します。1本のマウスに椅子ベルトを付け、マウスの前肢が不快な状態でリラックスした位置にある間、自然なサポートを提供します。
残りのマウスについても手順を繰り返します。各マウスを指定された椅子の上にそっと置き、椅子の背部支持に平行に、椅子の座席に90度で置きます。動物は押したり押したりすることなく、頭の下と前方の位置に自然に横たわるましょう。
すべてのマウスが縛られたら、すぐに鼻腔内接種を開始する。鼻腔内送達を行うために、マイクロピペットに2マイクロリットルのRVG9R siRNA複合体溶液をロードする。ピペットを支配的な手で握り、もう一方の手で支えて、siRNAを投与しながら制御不能な動きを避けます。
マウスが直接それを吸い込むことができるように、1つの鼻孔の近くに約2マイクロリットルの液滴を置きます。小さな落としが簡単に形成されない場合は、ピペットチップを新しいものに交換し、操作を繰り返します。マウスの頭を人差し指で5秒間軽く押し下げ、吸い込んで位置を維持します。
肺への薬物の排出を防ぐためには、マウスが吸入している間、人差し指でマウスの頭を5秒間押し下げるのが重要です。最初のマウスの第2のナレに時間接種するために、この後3〜4分クロックするストップウォッチを開始します。この時間間隔は、マウスが最初の用量の吸入を完了し、正常な呼吸を回復するために必要です。
第1マウス上の代替ナレスの接種の間の3〜4分間の間隔で、装置上に配置された残りの3匹のマウスのそれぞれに1つのナレの鼻内接種を完了する。ストップウォッチが鳴ったら、最初のマウスの2番目の鼻孔を接種し、上記のように他のマウスについても手順を繰り返します。4匹のマウスすべてに対して20~30マイクロリットルが送達されるまで手順を繰り返します。
接種手順全体を完了するには約30〜45分かかります。動物を指定ケージに戻します。彼らは胸骨の不用さを維持するために十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください.
遺伝子サイレンシングを評価するために、RNA精製キットを用いて様々な脳領域からRNAを抽出し、cDNA合成キットを用いてcDNAに逆転写し、プライマーペアでqPCRを行います。Alexa Fluor 488で標識されたRVG9Rペプチドの大部分の脳送達は、ここで説明したマウスポジショニング装置を用いて最初に試験した。接種後48時間で、様々な器官を切除してA488蛍光を測定した。
陰性対照のいずれの器官にも何も検出されなかった。一方、RVG9R接種群の脳内で強い蛍光A488シグナルが検出された。また、マウス配置位置を、有効性に対するサイン位置法および覚醒方法と比較した。
結果は、マウスの頭を下にして前方に配置することで、脳組織全体のRVG9R A488の浸透と堆積が改善されたことを示した。脳へのsiRNA送達をさらに確認するために、完全脳スキャンは、Cy5標識siRNAに複合体化したRVG9Rの単回鼻腔内投与後に行われた。PBSまたはRVM9Rとは対照的に、RVG9Rとの複合体化は、嗅球、皮質、海馬、視床、視床下部、脳中脳、小脳を含む主要な脳領域におけるsiRNAの強力な蓄積をもたらした。
位置決め装置は、マウスCNSへの薬物または分子の送達に使用することができる。アプリケーションは、治療薬のテストだけでなく、CNSの細胞機構を調べることに及ぶ。この位置付け装置は、西ナイルウイルス疾患の治療におけるsiRNAの効力を実証し、他のCNS疾患の治療法を探求するために研究者によって使用されてきた。
