Este protocolo proporciona un método funcional a largo plazo, in vitro, para la evaluación del receptor de antígeno quimérico, o células T CAR, a través del desafío repetitivo de las células tumorales. Esta técnica consume menos tiempo y consume menos trabajo que la evaluación de la función de células T CAR in vivo, al tiempo que logra una representación precisa de la verdadera eficacia antitumo tumoral. Esta técnica in vitro permite el cribado de alto rendimiento y la diferenciación de la potencia antitumorátuma de las células T CAR.
Que tiene la aplicación potencial para evaluar la eficacia clínica de los productos de células T CAR. Comience por disociar las tumoresferas del glioblastoma de un cultivo de tumoresfera del glioblastoma. Con un mililitro de acutasa fría, y 30 a 60 segundos de pipeteo.
Cuando las tumoresferas se hayan interrumpido, detenga la reacción con cinco mililitros de medio de co-cultivo cálido. Y peletiza las suspensiones de células tumorales por centrifugación. Re-suspenda las células del glioblastoma a un 1,6 veces 10 a las quintas células tumorales por mililitro de cocultivo fresco de concentración media, y diluya las células T cosechadas de un cultivo de células T CAR al porcentaje adecuado de células T positivas CAR por mililitro de concentración media de cocultivo.
A continuación, agregue 100 microlitros de las células tumorales diluidas a cada pozo de una placa de cultivo de tejido inferior plano de 96 pozos. Y 100 microlitros de células T CAR en cada pozo de células tumorales con mezcla suave. A continuación, coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius, 5%.
En los días dos, cuatro y seis de cultivo, retire cuidadosamente 50 microlitros de medio de cada pozo de la célula tumoral, placa de co-cultivo de células T programada para requellenge de acuerdo con la tabla. Luego, agregue 50 microlitros de suspensión de células de glioblastoma fresco, preparados como se acaba de demostrar, pero con el doble de número de células del co-cultivo inicial a cada pozo con mezcla suave. Y devolver la placa a la incubadora de cultivo celular.
Los días uno, tres, cinco y siete de co-cultivo, transfieran el sobrenadante de cada pozo para ser cosechados en una nueva placa inferior bien redonda de 96 según la mesa y agreguen 50 microlitros de precalentado 0.5%Trypsin EDTA en cada medio bien agotado. Después de cinco minutos a 37 grados Celsius, confirme que las células se han separado de la parte inferior de cada pozo por microscopía de luz, y pipetee suavemente la solución enzimática alrededor de la parte inferior de cada pozo para resuspender las células. Antes de transferir la suspensión de celda separada a los pozos correspondientes apropiados de la nueva placa de 96 pozos.
Pelecila las células por centrifugación, y lave las células con 200 microlitros de fluorescentes activados solución de clasificación celular, o FFS por pozo con un segundo centrifugación. Re-suspenda los pellets en 100 microlitros del cóctel de anticuerpos de interés en 100 microlitros de SSS por pozo para una incubación de 30 minutos a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación se elimina cualquier anticuerpo no consolidado mediante lavados secuenciales de 100 y 200 microlitroS FSS y re-suspender las células en 100 a 200 microlitros de la mancha nuclear DAPI y FSS.
Luego, analice las células de acuerdo con los protocolos de análisis citométrico de flujo estándar. Para el análisis funcional y fenotípico de las células T CAR después del co-cultivo de células tumorales, recupere los archivos de datos del citómetro de flujo y puerta a todas las células negativas DAPI vivas. Para cuantificar las células tumorales, atenen la población negativa CD45.
Para cuantificar los células T CAR puerta la población positiva CD45 CAR positiva. A continuación, trazar el tumor y los números de células T CAR a lo largo del curso del experimento, identificando la activación de la célula T por la coexpresión de 41BB, y CD69. El agotamiento de la célula T por la expresión de PD1, LAG3 y TIM3, y el estado de memoria de la célula T LAG3 y TIM3, y el estado de la memoria de la célula T por CD45RO, y la expresión de ligando CD62.
por CD45RO, y CD62 ligand expression. Tanto las células T CAR positivas CD4 como las células T positivas CD8 se activan por igual contra las células del glioblastoma que expresan el antígeno objetivo según lo indicado por su expresión de CD107a y citoquina intracelular. Sin embargo, según lo evaluado por el desafío de tumor repetitivo SA, CD4 positivo, pero no CD8 positivo, células T CAR son capaces de matar múltiples rondas.
Los células T de CAR positivas CD4 también logran una expansión más robusta. Cuando las células T CAR POSITIVAs CD4 se mezclan en una proporción de uno a uno, esta combinación de células realiza células T CAR CD8 positivas, pero no CD4 positivas en términos de citotoxicidad a largo plazo. Además, la expansión de los células T DE COCHE POSITIVAs CD8 es inducida por la adición de células T positivas CD4.
Mientras que la expansión positiva de la célula T CAR CD4 se inhibe en presencia de células positivas CDa. 24 horas después del co-cultivo inicial, las células CD4 positivas de CAR T se activan de forma similar. Durante el desafío del tumor repetitivo, las células CD4 positivas de CAR T demuestran una transición de un fenotipo de memoria central positivo de ligan CD45RO, ligan CD62, a un fenotipo de memoria de efecto negativo CD62 positivo CD45RO.
Las células T positivas de CAR CD8 también son más propensas al agotamiento en comparación con las células T de CAR positivas CD4 evaluadas por su expresión PD1, LAG3 y TIM3 después de tres días de co-cultivo. Además, no se observan diferencias en el agotamiento positivo de las células T CDa en el CAR en presencia o ausencia de células T positivas CD4, lo que indica que la expansión de células T CD8 positivas cd8 inducida por CD4 no está asociada con una mejor función del efector. Este ensayo también se puede combinar con la clasificación de las células T que forman el cocultivo para realizar análisis adicionales sobre transcriptomas, proteómicas y genes específicos de interés.
Este desafío tumoral repetitivo también podría utilizarse como plataforma para investigar los eventos biológicos después del reconocimiento del tumor de la célula T CAR.
