Este protocolo fornece um método funcional de longo prazo, in vitro, para a avaliação do receptor de antígeno quimérico, ou células CAR T, através de desafio celular tumoral repetitivo. Esta técnica é menos demorada e menos trabalhosa do que a avaliação da função celular IN VIVO CAR T, ao mesmo tempo em que consegue uma representação precisa da verdadeira eficácia anti-tumor. Esta técnica in vitro permite a triagem de alto rendimento e diferenciação da potência anionfí tumoral da célula CAR T.
Que tem a aplicação potencial para avaliar a eficácia clínica dos produtos celulares CAR T. Comece por dissociar tumores de glioblastoma de uma cultura glioblastoma tumorsphere. Com um mililitro de accutase frio, e 30 a 60 segundos de pipetação.
Quando os tumores tiverem sido interrompidos, pare a reação com cinco mililitros de meio de co-cultura quente. E pelotar as suspensões das células tumorais por centrifugação. Suspenda as células de glioblastoma para uma redução de 1,6 vezes 10 para o quinto tumoral por mililitro de concentração média de cocultura fresca, e diluir células T colhidas de uma cultura celular CAR T para a porcentagem apropriada de células T positivas CAR por mililitro de concentração média de cocultura.
Em seguida, adicione 100 microliters das células tumorais diluídas a cada poço de uma placa de cultura de tecido fundo bem plana de 96. E 100 microliters de células CAR T em cada poço de células tumorais com mistura suave. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono.
Nos dias dois, quatro e seis da cultura, remova cuidadosamente 50 microliters de médio de cada poço da célula tumoral, placa de cocultura de células T programada para recoleção de acordo com a tabela. Em seguida, adicione 50 microliters de suspensão celular glioblastoma fresco, preparado como apenas demonstrado, mas com o dobro do número celular da co-cultura inicial a cada poço com mistura suave. E devolva a placa à incubadora de cultura celular.
Dias um, três, cinco e sete de co-cultura, transfira o supernante de cada poço para ser colhido em uma nova placa inferior redonda de 96 de acordo com a tabela e adicione 50 microliters de 0,5% edta de trypsin em cada poço empobrecido médio. Após cinco minutos a 37 graus Celsius, confirme que as células se separaram da parte inferior de cada poço por microscopia leve, e pipeta suavemente a solução enzimápica ao redor da parte inferior de cada poço para resuspensar as células. Antes de transferir a suspensão da célula destacada para os poços correspondentes apropriados da nova placa de 96 poços.
Pelotar as células por centrifugação, e lavar as células com 200 microliters de fluorescentes ativados solução de classificação celular, ou FFS por poço com uma segunda centrifugação. Suspenda as pelotas em 100 microliters do coquetel de anticorpos de interesse em 100 microliters de SSS por poço para uma incubação de 30 minutos a quatro graus Celsius. A extremidade da incubação remover qualquer anticorpo desvinculado por lavagens FSS sequenciais de 100 e 200 microliteres e suspender as células em 100 a 200 microliters de mancha nuclear DAPI e FSS.
Em seguida, analise as células de acordo com protocolos de análise citométrica de fluxo padrão. Para análise funcional e fenotípica das células CAR T após a co-cultura das células tumorais, recupere os arquivos de dados do citômetro de fluxo e proteva todas as células negativas da DAPI ao vivo. Para quantificar as células tumorais, portal a população CD45 negativa.
Para quantificar as células CAR T, o cd45 positivo car população positiva. Em seguida, plote os números de células tumorais e CAR T ao longo do tempo do experimento, identificando a ativação de células T pela co-expressão de 41BB e CD69. Exaustão de células T pela expressão de PD1, LAG3 e TIM3, e o status de memória de células T LAG3, e TIM3, e o status de memória de célula T por CD45RO, e expressão ligante CD62.
por CD45RO, e cd62 expressão ligand. Tanto as células CD4 positivos quanto as células CAR T positivas são igualmente ativadas contra células glioblastoma que expressam o antígeno alvo, conforme indicado por sua expressão CD107a e citocina intracelular. No entanto, como avaliado pelo desafio do tumor repetitivo SA, CD4 positivo, mas não CD8 positivo, as células CAR T são capazes de matar múltiplas rodadas.
As células CAR T positivas CD4 também alcançam uma expansão mais robusta. Quando as células CD4 positivas, e CD8 positive CAR T são misturadas em uma proporção de um para um, esta combinação de células executa cd8 positiva, mas não células CAR T positivas CD4 em termos de citotoxicidade de longo prazo. Além disso, a expansão das células CAR T positivas CD8 é induzida pela adição de células T cd4 positivas.
Enquanto a expansão positiva das células CAR T do CD4 é inibida na presença de células positivas de CDa. 24 horas após a co-cultura inicial, as células CAR T positivas cd4 e CD8 são ativadas da mesma forma. Durante o desafio do tumor repetitivo, as células CAR T positivas cd4 e CD8 demonstram uma transição de um fenótipo de memória central cd45RO positivo, para um fenótipo de memória de efeito negativo CD62 cd62 negativo cd62.
As células CAR T positivas CD8 também são mais propensas à exaustão em comparação com as células CAR T positivas CD4, conforme avaliado por sua expressão PD1, LAG3 e TIM3 após três dias de co-cultura. Além disso, não observadas diferenças observadas na exaustão positiva da célula CAR T CDa na presença ou ausência de células T positivas cd4, indicando que a expansão positiva da célula CAR T cd8 induzida pelo CD4 não está associada a uma melhor função de efeito. Este ensaio também pode ser associado à classificação das células T formam a co-cultura para realizar análises mais aprofundadas em transcriptomes, proteômicas e genes específicos de interesse.
Esse desafio repetitivo do tumor também pode ser usado como plataforma para investigar os eventos biológicos pós reconhecimento de tumor de células CAR T.
