Bu protokol, tekrarlayan tümör hücresi mücadelesi yoluyla, şimerik antijen reseptörünün veya CAR T hücrelerinin değerlendirilmesi için uzun süreli, in vitro, fonksiyonel bir yöntem sağlar. Bu teknik daha az zaman alıcı, ve daha az emek yoğun in vivo CAR T hücre fonksiyon değerlendirmesi hala gerçek anti-tümör etkinliğini doğru bir temsil elde ederken. Bu in vitro tekniği, CAR T hücreli anti-tümör potensinasyonunun yüksek iş gücü taraması ve farklılaşmasını sağlar.
Hangi CAR T hücre ürünlerinin klinik etkinliğini değerlendirmek için potansiyel bir uygulama vardır. Glioblastoma tümörkürelerini glioblastoma tümörküre kültüründen ayırarak başlayın. Bir mililitre soğuk birikme ve 30-60 saniyelik pipetleme ile.
Tümör küreleri bozulduğunda, beş mililitre sıcak ortak kültür ortamıyla reaksiyonu durdurun. Ve pelet tümör hücresi santrifüj ile süspansiyonlar. Glioblastoma hücrelerini taze coculture orta konsantrasyonunun mililitre başına 1,6 katı 10'a kadar yeniden askıya alın ve CAR T hücre kültüründen alınan t hücrelerini co-kültür orta konsantrasyonun mililitrebaşına uygun yüzdesine kadar seyreltin.
Sonra, seyreltilmiş tümör hücrelerinin 100 mikrolitre ekleyin her kuyuya 96 iyi düz alt doku kültür plakası. Ve 100 mikrolitre CAR T hücresi tümör hücrelerinin her kuyunun içine nazik karıştırma ile. Sonra plakayı 37 derece santigrat derece, %5 karbondioksit kuvöze yerleştirin.
Kültürün ikinci, dördüncü ve altı günlerinde, tümör hücresinin her kuyusundan 50 mikrolitre orta yı dikkatlice çıkarın, T hücresi ortak kültür plakası tabloya göre yeniden meydan okuma için planlandı. Sonra, taze glioblastoma hücre süspansiyon 50 mikrolitre ekleyin, sadece gösterildiği gibi hazırlanan, ancak nazik karıştırma ile her iyi ilk co-kültür iki kat hücre numarası ile. Ve plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine geri ver.
Gün bir, üç, beş, ve yedi co-kültür, tabloya göre yeni bir 96 iyi yuvarlak alt plaka içine hasat edilecek her kuyudan supernatant aktarın ve her orta içine önceden ısıtılmış 50 mikrolitre ekleyin 0.5% Trypsin EDTA iyi tükenmiş. 37 santigrat derece beş dakika sonra, hücrelerin ışık mikroskobu ile her kuyunun alt müstakil olduğunu onaylamak, ve yavaşça hücreleri yeniden askıya almak için her kuyunun alt etrafında enzim çözeltisi pipet. Müstakil hücre süspansiyonu yeni 96 kuyu plakasının uygun kuyularına aktarmadan önce.
Santrifüj ile hücreleri pelet, ve floresan 200 mikrolitre ile hücreleri yıkayın hücre sıralama ayakta çözeltisi aktive, ya da FFS iyi başına ikinci bir santrifüj ile. Dört santigrat derecede 30 dakikalık bir kuluçka için iyi başına 100 mikrolitre SSS ilgi antikor kokteyl 100 mikrolitre pelet yeniden askıya. Kuluçka sonunda sıralı 100 ve 200 mikrolitre FSS tarafından herhangi bir bağlanmamış antikor kaldırmak ve DAPI nükleer leke ve FSS 100 ila 200 mikrolitre hücreleri yeniden askıya.
Daha sonra, hücreleri standart akış sitometrik analiz protokollerine göre analiz edin. Tümör hücre eş kültüründen sonra CAR T hücrelerinin fonksiyonel ve henotipik analizi için, akış sitometreveri veri dosyalarını almak ve tüm canlı DAPI negatif hücreleri kapısı. Tümör hücrelerini ölçmek için, CD45 negatif popülasyonkapısı.
CAR T hücrelerini ölçmek için CD45 pozitif CAR pozitif popülasyonu kaplar. Daha sonra deney boyunca tümör ve CAR T hücre numaralarını çizin, T hücre aktivasyonunu 41BB ve CD69'un ortak ifadesi yle tanımlayın. PD1, LAG3 ve TIM3 ifadesi ile T hücre tükenmesi ve T hücre bellek durumu LAG3 ve TIM3 ve CD45RO ve CD62 ligand ifadesi ile T hücre bellek durumu.
CD45RO ve CD62 ligand ifade tarafından. Hem CD4 pozitif, hem de CD8 pozitif CAR T hücreleri, CD107a ve hücre içi sitokin ekspresyonunda belirtildiği gibi hedef antijeni ifade eden glioblastoma hücrelerine karşı eşit derecede aktive olurlar. Ancak, tekrarlayan tümör meydan SA tarafından değerlendirildiği gibi, CD4 pozitif, ama CD8 pozitif değil, CAR T hücreleri birden fazla yuvarlak öldürme yeteneğine sahiptir.
CD4 pozitif CAR T hücreleri de daha sağlam bir genişleme elde. CD4 pozitif ve CD8 pozitif CAR T hücreleri bire bir oranında karıştırıldığında, bu hücre kombinasyonu CD8 pozitif gerçekleştirir, ancak uzun vadeli sitotoksisite açısından CD4 pozitif CAR T hücreleri. Buna ek olarak, CD8 pozitif CAR T hücrelerinin genişlemesi CD4 pozitif T hücrelerinin eklenmesi ile indüklenir.
CD4 pozitif CAR T hücre genişlemesi CDa pozitif hücrelerin varlığında inhibe ederken. İlk ortak kültürden 24 saat sonra hem CD4 pozitif hem de CD8 pozitif CAR T hücreleri benzer şekilde aktive edilir. Tekrarlayan tümör mücadelesi sırasında, hem CD4 pozitif hem de CD8 pozitif CAR T hücreleri CD45RO pozitif, CD62 ligan pozitif santral bellek fenotip, CD45RO pozitif CD62 ligan negatif efektör bellek fenotip bir geçiş göstermektedir.
CD8 pozitif CAR T hücreleri de daha fazla co-kültür üç gün sonra kendi PD1, LAG3 ve TIM3 ifade tarafından değerlendirilen CD4 pozitif CAR T hücreleri ile karşılaştırıldığında bitkinlik eğilimli. Ayrıca, CD4 pozitif T hücrelerinin varlığında veya yokluğunda CDa pozitif CAR T hücre tükenmesinde gözlenen hiçbir farklılık yoktur, CD4 indüklenen CD4 indüklenen CD8 pozitif CAR T hücre genişlemesidaha iyi bir efektör fonksiyonu ile ilişkili olmadığını gösteren. Bu makale aynı zamanda t hücreleri transkripsiyonlar, proteomik ve ilgi belirli genler üzerinde daha fazla analiz yapmak için ortak kültür formu sıralama ile birleştiğinde olabilir.
Bu tekrarlayan tümör sorun da biyolojik olayları araştırmak için bir platform olarak kullanılabilir sonra CAR T hücre li tümör tanıma.
