Este protocolo ofrece una estrategia rápida y eficiente para utilizar simultáneamente dos ensayos para examinar varios cientos de compuestos por sus efectos en el crecimiento celular. Los ensayos pueden proporcionarnos información sobre si compuestos específicos son citotóxicos, inhiben el crecimiento celular o mejoran el crecimiento celular. Mediante la utilización de los dos ensayos juntos, somos capaces de aumentar la precisión e identificar compuestos citotóxicos.
En los casos en que los resultados de los dos ensayos divergen, esta estrategia puede permitirnos identificar compuestos con efectos únicos sobre la función celular que pueden ser examinados más a fondo por otros medios. La principal ventaja de esta estrategia es que es rápida, barata y no intensiva en mano de obra. Una vez masterado, permite a los investigadores realizar fácilmente una pantalla primaria de hasta 200 compuestos en una semana, y luego realizar una curva de respuesta a la dosis exhaustiva en 10 Para 15 compuestos en otra semana.
Demostrando el procedimiento seremos Rohini Manickam y yo, un científico del personal y becario post-bachillerato del laboratorio. En primer lugar, en un gabinete de seguridad biológica, las células de cultivo en un matraz T75 con medio NSC para que tengan al menos un 80% de confluencia al iniciar el ensayo. Y coloque el matraz en una incubadora de cultivo celular situada en 37 grados celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono.
Una vez que las células alcancen el 80% de confluencia, retire el matraz de la incubadora y aspire el medio NSC. Añadir tres mililitros de reactivo de disociación celular e incubar durante cinco minutos en la incubadora. Después de la incubación, agregue siete mililitros de medio NSC en el matraz, y pipetee vigorosamente para asegurar que todas las células se desprendan.
Transfiera la solución celular disociada a un tubo de 15 mililitros y centrifugar a 200 veces G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante del tubo y vuelva a suspender las células en 10 mililitros de medio NSC. Utilice un contador de células automatizado o hemocitoómetro para contar las células, y agregue el medio NSC en el tubo para reajustar la concentración de células a 200.000 células por mililitro.
A continuación, utilizando seis de las ocho ranuras de un pipeteador multicanal de ocho canales para la placa 100 microlitros de la mezcla celular columna por columna en 60 pozos interiores de tres placas de 96 pozos que han sido recubiertos por matriz extracelular. Agregue 100 microlitros de medio base o medio NSC a todos los pozos sin células para minimizar la evaporación potencial de los pozos exteriores que contienen células. Bajo un microscopio de cultivo celular, inspeccione visualmente al menos 10 pozos en cada una de las tres placas de 96 pozos para confirmar que las células están sentadas a la densidad esperada.
Incubar a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono. Retire las placas de cultivo celular de la incubadora de 16 a 24 horas después de la división, y aspire la columna media NSC por columna con un pipeteador multicocho de ocho canales, utilizando sólo seis de las ocho ranuras de varios pozos. Agregue 95 microlitros de medio NSC fresco a cada pozo de las tres placas de réplica y vuelva a colocar las placas en la incubadora.
Con un pipettor multi-pozo de ocho canales, agregue 49 microlitros de medio NSC en cada uno de los pozos interiores de 60 pozos de una placa vacía de fondo en U, con fondo en V o de fondo redondo de 96 pozos. Desapreoña la placa compuesta maestra preparada. Pipetear un microlitro del compuesto de la placa maestra en cada uno de los 60 pozos interiores que contienen el medio NSC, y mezclar el compuesto diluido tres veces con un pipeteador de sobremesa.
A continuación, retire las tres placas de 96 pozos de las RSE de la incubadora y dispense cinco microlitros del compuesto diluido en cada pozo de las tres placas que contienen células para producir una dilución de uno a 1000 para la concentración compuesta final de 10 micromolares con una concentración de DMSO de 0,1% Incubar células con compuesto durante 72 horas, y proceder con ensayos de citotoxicidad. Para realizar el ensayo de respuesta a la dosis, configure un pozo de 96. Utilice la columna dos para seis réplicas de control DMSO y pruebe triplicados de hasta tres compuestos diferentes a dos diluciones seriales dobles, a seis dosis, comenzando con una dosis alta de 10 micromolares.
Diluir cuatro microlitros de 100%DMSO o compuesto de ensayo en DMSO en 196 microlitros de medio NSC en un tubo de microcentrífuga de 0,5 o 1,5 mililitros. Añadir 25 microlitros del DMSO diluido para controlar los pozos, y 50 microlitros de los compuestos de prueba diluidos a sus pozos correspondientes. Pipetear 25 microlitros de medio NSC a los pozos vacíos restantes en la parte interior de la placa de 96 pozos.
Con un pipettor multicanal, transfiera 25 microlitros del compuesto de los 10 pozos micromolares a los cinco pozos micromolares, y mezcle al menos cinco veces. Sustituya las puntas de la pipeta y repita el proceso mezclando las filas restantes para generar triplicados a dos diluciones para un total de seis dosis para cada uno de los compuestos. Transfiera cinco microlitros de cada dilución a una nueva placa con células de cultivo que se están probando.
Coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono. Después de que las células hayan sido incubadas durante 72 horas, retire la placa de la incubadora y colóquela dentro del lector de placas. Abra el software imager para configurar archivos de protocolo y experimento para el estudio.
Vaya al modo manual de Imager en el Administrador de tareas y haga clic en Capturar ahora. Elija la placa de 96 pozos como el tipo de recipiente. Seleccione 10 veces para el aumento y la proteína fluorescente roja 531 y 593 para la toma de imágenes de tdTomato.
Haga clic en un pozo. A continuación, haga clic en Enfoque automático para enfocar la imagen y Exponer automáticamente para obtener el tiempo de exposición adecuado. Ajuste manualmente el enfoque y la exposición si es necesario.
Haga clic en el icono de la cámara para capturar la imagen. A continuación, haga clic en Procesar analizar la imagen anterior para continuar creando el protocolo. Y seleccione la pestaña Análisis.
A la derecha de la imagen, haga clic en Análisis celular en Agregar paso de análisis y haga clic en Iniciar. La imagen muestra celdas resaltadas para indicar cada celda individual. Haga clic en la selección Opciones para modificar los parámetros para seleccionar mejor las celdas en función del umbral de fluorescencia o el tamaño de celda.
Si el imager está contando correctamente las celdas, haga clic en Agregar paso en la parte inferior de la pantalla. Haga clic en el icono en la parte superior de la pantalla para crear un experimento a partir del conjunto de imágenes. Y en la ventana abierta, haga clic en Procedimiento en la pestaña Protocolo.
A continuación, en la nueva ventana que se abre, seleccione Leer. Haga clic en Placa completa para seleccionar solo los 60 pozos que contienen las celdas. Haga clic en Aceptar para guardar los cambios.
A continuación, haga clic en Aceptar en la ventana Procedimiento. Haga clic en el icono Reproducir para ejecutar la placa. En el símbolo del sistema, guarde el archivo y, a continuación, en la solicitud Cargar placa, haga clic en Aceptar. Al finalizar la imagen, descargue los datos del recuento de celdas del programa de software del imager a una hoja de cálculo para su análisis.
Dentro de las dos horas siguientes a la finalización de la toma de imágenes tdTomato, comience el ensayo de MTT. Pesar 25 miligramos de MTT y volver a suspenderlo en cinco mililitros de medio NSC para hacer cinco miligramos por mililitro solución de stock MTT. Vórtice la solución durante varios minutos, hasta que no haya precipitados visibles de MTT.
Retire las placas de cultivo celular de la incubadora y aspire fuera del medio de cultivo celular. Diluir MTT de uno a 10 en medio NSC fresco, y añadir 100 microlitros del MTT diluido a cada pozo de células. Incubar células a 37 grados centígrados durante dos horas.
Un precipitado púrpura es visible aproximadamente en proporción al número de células en el pozo. Aspirar la solución MTT de las placas y añadir 50 microlitros de 100%DMSO a cada pozo. Coloque las placas en una coctelera a temperatura ambiente durante 10 minutos a 400 RPM.
Después de eso, transfiera la placa a un lector de placas. Lea la absorbancia de cada pozo en la longitud de onda preestablecida de 595 nanómetros y exporte datos a hoja de cálculo para su análisis, exactamente como para los datos de recuento de celdas. El examen de las imágenes de fluorescencia tdTomato reveló dos pozos discordantes para la toxicidad entre el MTT y el ensayo de recuento de células.
Para un pozo, los datos del recuento celular sugirieron que no había toxicidad. Pero los datos de MTT sí. Otro bien había sobreestimado el recuento de células por MTT en relación con el recuento de tdTomato, y parecía tener células más grandes, mientras que en pozos donde MTT subestimó el recuento de células en relación con tdTomato, las células parecían ser más pequeñas.
En resumen, el ensayo tdTomato clasificó 11 compuestos como tóxicos, 11 como inhibidores del crecimiento, y uno como mejora del crecimiento, con 34 sin efecto aparente sobre el crecimiento celular. El ensayo MTT clasificó 13 compuestos como tóxicos, dos como inhibidores del crecimiento, y uno como mejora del crecimiento, con 41 sin efecto aparente sobre el crecimiento celular. El gráfico de células viables para el compuesto WP1066 muestra una curva relativamente plana sin toxicidad para las cuatro concentraciones más bajas.
La curva cae rápidamente en la dosis de cinco micromolares, y cae a toxicidad casi total a 10 micromolares, lo que conduce a la dosis letal 50 como 4,4 y 6,0 micromolar para el ensayo tdTomato y el ensayo MTT. Es fundamental que los compuestos se diluyen correctamente en la pantalla de respuesta a la dosis para que se genere la curva de respuesta de dosis correcta. Los compuestos identificados por este procedimiento para afectar el crecimiento celular se pueden caracterizar aún más por ensayos funcionales para identificar vías de señalización potencialmente novedosas que controlan el crecimiento celular.
Los compuestos que son tóxicos para las células madre neurales se han probado como agentes terapéuticos potenciales para los cánceres cerebrales, como el glioblastoma y el neuroblastoma. Use siempre guantes y una capa de laboratorio cuando manipule células de mamíferos, DMSO y MTT. Deseche DMSO y MTT de acuerdo con las Directrices de Residuos Químicos de su institución.
