Aqui apresentamos um sistema automatizado baseado em tomografia de coerência óptica ou OCT. Isso nos permite monitorar a estrutura dos biofilmes em grandes escalas espaciais ou longos períodos de tempo. A imagem OCT é adequada para resolver estruturas na faixa de micrômetros, no entanto, está atualmente limitada a uma área máxima de cerca de 250 milímetros quadrados.
Os biofilmes muitas vezes excedem essa escala, especialmente quando a diferenciação é impulsionada por gradientes ambientais em larga escala. A configuração experimental nos permite monitorar a morfogênese tridimensional de biofilmes em grandes escalas espaciais e longos períodos de tempo. O sistema é rápido, preciso, e funciona de forma autônoma.
Estudamos a morfogênese dos biofilmes em córregos onde eles conduzem processos ecossistêmicos importantes. No entanto, o sistema pode ser usado para estudar biofilmes em outros sistemas naturais ou ambientes projetados. O software para posicionamento, aquisição de imagens e análise está escrito em Python.
Eles estão disponíveis através de Cadernos Jupyter. São soluções fáceis de usar, disponíveis gratuitamente e flexíveis. Acreditamos que a representação visual da configuração ajuda outros usuários a reproduzir a instalação e a entender melhor o software.
Esperamos que isso inspire outros pesquisadores a adotar abordagens semelhantes. Aqui está uma visão geral da instalação. O sistema é composto por um dispositivo de posicionamento de precisão, a sonda OCT, e é montado em torno de um flume de plexiglass.
Comece por fiação do dispositivo de posicionamento seguindo junto com instruções publicadas no GitHub. Uma vez conectado, instale o servidor GRBL conforme descrito em uma página gitLab separada. O sistema de posicionamento agora pode ser controlado através desta página da Web;alternativamente, ele pode ser controlado através de um script Python, como mostrado no exemplo trabalhado.
Posicione o computador e a unidade base de OCT em um banco próximo à configuração experimental contendo dispositivos microfluidos, câmaras de fluxo, flumes ou sistemas de filtragem. Se ainda não estiver instalado, instale o sistema OCT juntamente com o software disponível, conforme descrito pelo fabricante. Em seguida, instale os pacotes de software para aquisição automatizada de varredura de OCT, conforme descrito nos documentos do GitLab vinculados a aqui.
Para iniciar a aquisição de imagens, monte a sonda de tomografia de coerência óptica no dispositivo de posicionamento usando um suporte de rabo de pomba compatível. Se necessário, instale um adaptador de imersão na lente objetiva e, em seguida, ligue o sistema OCT e o dispositivo de posicionamento. Abra o software de OCT comercial, localize um local de interesse, foque na amostra e ajuste a intensidade do braço de referência e da fonte de luz para a qualidade ideal da imagem.
Observe as coordenadas e repita este procedimento para uma série de posições, mantendo o mesmo comprimento e intensidade do braço de referência. Abra a Citação de Imagens. ipynb arquivo encontrado no Arquivo Suplementar 2 deste artigo no Caderno Jupyter.
Cada célula contém código para executar tarefas específicas e pode ser executada separadamente através da pressão Cell e, em seguida, Executar ou Controlar e Entrar ou Entrar. Siga o exemplo trabalhado para definir o caminho para as bibliotecas necessárias para conectar o dispositivo de posicionamento para calibrar o dispositivo de posicionamento para inicializar o scanner OCT. Em seguida, ajuste os parâmetros de aquisição, incluindo o índice de refração, o tamanho do campo de visão e o número de varreduras A por b.
Além disso, defina os limites de sinal da varredura de OCT com base em histogramas de intensidade de varreduras preliminares e da pasta de destino para dados adquiridos e metadados. Dependendo do campo de exibição e resolução, o tamanho do arquivo pode atingir até 1,5 gigabytes por varredura de OCT. Esses dois parâmetros determinam o tamanho dos voxels no conjunto de dados final e o tamanho do arquivo de saída.
Eles devem corresponder à resolução óptica da sonda OCT. Como destacado no exemplo trabalhado, você pode adquirir uma única varredura de OCT com parâmetros padrão ou adquirir uma única varredura especificando um conjunto diferente de parâmetros. Você também pode fornecer coordenadas específicas para mover o dispositivo de posicionamento e adquirir uma única varredura de OCT.
Este recurso permite que você retorne repetidamente à mesma posição no experimento com alta precisão espacial. Os dados são salvos em 8bit. formato bruto para economizar espaço de armazenamento.
Os metadados, incluindo as configurações e coordenadas de OCT, são salvos na mesma pasta em um arquivo json com a mesma convenção de nomeação. Alternativamente, especifique uma lista de posições de interesse e adquira as respectivas varreduras oct automaticamente. Para caracterizar estruturas morfológicas biofilmas em grandes gradientes ambientais, adquira varreduras em um padrão de mosaico.
Para isso, especifique o número de telhas vizinhas com uma sobreposição padrão de 30% As varreduras de OCT brutas parecem distorcidas. Isso se deve a diferenças no comprimento do caminho através do sistema óptico. Desenvolvemos um algoritmo que corrige essa distorção como mostrado nos exemplos trabalhados.
Para iniciar a correção de imagem, abra o notebook Jupyter ImageProcessing.ipynb. Seguindo este exemplo, primeiro corte as varreduras de OCT a fim de excluir sinais espúrios e reorientar o conjunto de dados para que o biofilme apareça acima do substrato. Próximo correto para aberração esférica.
Para isso, o algoritmo localiza uma superfície plana altamente reflexiva na varredura de OCT e usa isso como referência para achatar as varreduras. Através de uma grade de 20 por 20, o algoritmo então identifica máximas locais em intensidade de sinal para localizar a superfície de referência. Em seguida, uma superfície polinomial de segunda ordem é instalada através desses pontos e usada para deslocar cada pixel da varredura OCT na direção Z.
Os parâmetros deste algoritmo devem ser ajustados às características da varredura de OCT. Esta correção permite uma superfície de referência homogênea em várias imagens e, portanto, facilita a costura de imagens em larga escala. Uma vez que a imagem tenha sido achatada, as imagens são corrigidas para ruído de fundo, identificando uma área vazia da imagem acima do biofilme e subtraindo a intensidade média de fundo.
Em seguida, calcule um mapa de elevação do conjunto de dados 3D OCT. Para isso, defina uma superfície de referência como o substrato e escolha um limiar de intensidade adequado. Em seguida, um mapa de elevação é renderizado com a altura do biofilme relatado como valor em escala de cinza.
Se as imagens foram adquiridas em um padrão de mosaico, costure os respectivos mapas de elevação aplicando o algoritmo de costura. Utilizando imagens automatizadas de OCT, a morfogênese espocrânica de biofilmes de fluxo fototrófico foi examinada usando experimentos de flume. As flumes são feitas de plexiglass e gradualmente aumentam do para dentro para a saída.
Isso resulta em um gradiente em velocidade de fluxo. Aqui está um mapa de elevação de um biofilme crescendo ao longo de todo o gradiente de velocidade de fluxo. É importante ressaltar que o sistema automatizado de imagem OCT permite uma medição contínua de parâmetros estruturais, como espessura de biofilme, rugosidade e biovolume em diferentes condições de fluxo que vão desde a velocidade de baixo fluxo até condições de alta velocidade de fluxo.
Juntamente com as alterações morfológicas, o biovolume médio diminuiu significativamente em função da distância da entrada no flume. A qualidade dos exames de OCT depende criticamente do comprimento do braço de referência e da distância de foco. Você pode precisar reajustar este parâmetro durante os experimentos.
Para garantir a precisão do dispositivo de posicionamento, lembre-se de realizar operações regulares de localização. Este dispositivo de imagem automatizado pode ser facilmente acoplado com perfil de microsensor para uma caracterização funcional de biofilmes. O OCT é uma técnica emergente de imagem e antecipamos que o sistema aqui apresentado estimula pesquisas sobre estrutura de biofilme.
Isso pode ser relevante para tecnologias como tratamento de água potável ou bioprocessamento.
