ここでは、光コハレンス断層撮影またはOCTに基づく自動化システムを紹介します。これにより、大きな空間的スケールや長期間にわたってバイオフィルムの構造を監視することができます。OCTイメージングは、マイクロメートルの範囲の構造を解決するのに適しています, それは、現在、約250平方ミリメートルの最大面積に制限されています.
バイオフィルムは、特に大規模な環境勾配によって分化が駆動される場合、このスケールを超えることが多い。実験のセットアップにより、大きな空間的スケールと長期間にわたるバイオフィルムの3次元形態形成を監視することができます。システムは高速で正確で、自律的に動作します。
我々は、重要な生態系プロセスを推進する流れの中でバイオフィルムの形態形成を研究した。しかし、このシステムは、他の自然システムまたは工学的環境におけるバイオフィルムの研究に使用され得る。位置決め、画像取得、および分析のためのソフトウェアは、Pythonで書かれています。
これらはジュピターノートブックから入手できます。これらは、ユーザーフレンドリーで自由に利用でき、柔軟なソリューションです。セットアップの視覚的な表現は、他のユーザーがインストールを再現し、ソフトウェアをよりよく理解するのに役立つと考えています。
私たちは、これが他の研究者に同様のアプローチを採用するよう促すことを願っています。インストールの概要を次に示します。システムは精密位置決め装置、OCTの調査で構成され、プレキシガラスの煙のまわりで組み立てられる。
まず、GitHub に掲載された手順に従って、位置決めデバイスを配線します。接続したら、別の GitLab ページで説明されているように GRBL サーバーをインストールします。配置システムはこの Web ページを通じて制御できるようになりました。あるいは、作業例に示すように Python スクリプトを通して制御できます。
マイクロ流体デバイス、フローチャンバー、フリューム、またはろ過システムを含む実験用セットアップの隣にあるベンチにコンピュータとOCTベースユニットを配置します。まだインストールされていない場合は、製造元の説明に従って、OCT システムを利用可能なソフトウェアと共にインストールします。次に、ここにリンクされている GitLab ドキュメントで説明されているように、OCT スキャンの自動取得用のソフトウェア パッケージをインストールします。
画像取得を開始するには、適合するハベテールホルダーを使用して、光コヘレンス断層撮影プローブをポジショニングデバイスに取り付けます。必要に応じて、浸漬アダプタを対物レンズに取り付け、OCTシステムと位置付けデバイスの電源を入れます。商用OCTソフトウェアを開き、目的のサイトを見つけ、サンプルに焦点を当て、最適な画質を得るための基準アームと光源強度を調整します。
座標に注意し、同じ基準アームの長さと強度を維持しながら、いくつかの位置に対してこの手順を繰り返します。イメージ取得を開きます。この記事の補助ファイル 2 に含まれる ipynb ファイルは、Jupyter ノートブックにあります。
各セルには、特定のタスクを実行するためのコードが含まれていますし、セルを押して別々に実行し、実行または制御し、入力またはシフトとEnter.OCTスキャナを初期化するために位置決めデバイスをキャリブレーションするために配置デバイスを接続するために必要なライブラリへのパスを設定するために働いた例に従ってください。次に、屈折率、視野のサイズ、BスキャンごとのAスキャン数を含む取得パラメータを調整します。
さらに、予備スキャンの強度ヒストグラムと取得したデータとメタデータの宛先フォルダに基づいてOCTスキャンの信号境界を設定します。表示範囲と解像度によっては、ファイル サイズが OCT スキャンあたり最大 1.5 ギガバイトに達する場合があります。これらの 2 つのパラメーターは、最終データ・セット内のボクセルのサイズと出力ファイルのサイズを決定します。
OCT プローブの光学解像度と一致する必要があります。実際の例で強調したように、デフォルトのパラメータを使用して単一の OCT スキャンを取得するか、異なるパラメータセットを指定して 1 回のスキャンを取得できます。また、測位デバイスを移動し、単一のOCTスキャンを取得するための特定の座標を提供することもできます。
この機能を使用すると、実験内のまったく同じ位置に、高い空間精度で繰り返し戻すことができます。データは8ビットで保存されます。ストレージスペースを節約するためのrawフォーマット。
OCT の設定と座標を含むメタデータは、同じ名前付け規則を使用して json ファイル内の同じフォルダーに保存されます。または、対象の位置のリストを指定し、それぞれのOCTスキャンを自動的に取得します。大きな環境勾配を越えてバイオフィルム形態構造を特徴付けるために、モザイクパターンでスキャンを取得する。
このために、既定の重なりが 30% の隣接タイルの数を指定する未加工の OCT スキャンが歪んで表示されます。これは、光学系を通したパスの長さの違いによるものです。我々は、働いた例に示すように、この歪みを修正するアルゴリズムを開発しました。
画像の補正を開始するには、ジュピター ノートブックの ImageProcessing.ipynb を開きます。この例に続いて、まず、偽信号を除外するために OCT スキャンをトリミングし、バイオフィルムがサブストラタムの上に表示されるようにデータセットの方向を変更します。次に球面収差に対する修正。
これを実現するために、アルゴリズムは、OCT スキャンで反射性の高いフラット サーフェスをローカライズし、これを参照としてスキャンを平坦化します。20 %20グリッドにわたって、アルゴリズムは、参照表面を局地化するために信号強度の局所的な最大値を識別します。次に、2 次多項式サーフェスがこれらの点に合わせ、OCT スキャンの各ピクセルを Z 方向にシフトするために使用されます。
このアルゴリズムのパラメータは、OCT スキャンの特性に合わせて調整する必要があります。この補正により、複数の画像に均一な参照面が可能になり、大規模な画像のステッチが容易になります。画像が平坦化されると、画像は、バイオフィルムの上の画像の空いた領域を識別し、平均背景強度を差し引くことによって、バックグラウンドノイズのために補正されます。
次に、3D OCT データ セットから標高マップを計算します。そのためには、サブストラタムなどの参照サーフェスを定義し、適切な強度しきい値を選択します。次に、標高マップが、グレースケール値として報告されたバイオフィルムの高さでレンダリングされます。
画像がモザイクパターンで取得された場合は、ステッチアルゴリズムを適用して、それぞれの標高マップをステッチします。自動OCTイメージングを用いて、光栄養ストリームバイオフィルムの時空間的形態形成を、フリューム実験を用いて検討した。フリュームはプレキシガラスで作られており、徐々に中から流出まで広がります。
これにより、流速の勾配が生じます。流速勾配全体に沿って成長するバイオフィルムの標高マップを次に示します。重要なことに、自動化されたOCTイメージングシステムは、低流速から高流速条件に至るまで、異なる流れ条件下でバイオフィルム厚さ、粗さ、バイオ体積などの構造パラメータを連続的に測定することが可能です。
形態学的変化に伴い、平均バイオボリュームは、煙の中の入口からの距離の関数として有意に減少した。OCT スキャンの品質は、基準アームの長さと焦点距離によって大きく異なります。実験中にこのパラメータを変更する必要がある場合があります。
測位装置の正確性を確保するために、定期的にホーミング操作を行うことを忘れないでください。この自動イメージング装置は、バイオフィルムの機能的特性を得るためのマイクロセンサープロファイリングと容易に結合することができる。OCTは新たなイメージング技術であり、ここで発表されたシステムがバイオフィルム構造の研究を刺激すると予想しています。
これは、飲料水処理やバイオプロセシングなどの技術に関連する可能性があります。
