La evaluación del compromiso objetivo, es decir, la interacción de un medicamento con la proteína para la que fue diseñado, es un requisito básico para la interpretación de la actividad biológica de cualquier compuesto en el desarrollo de fármacos, o en proyectos de investigación básica. La principal ventaja de esta técnica es que permite la medición directa del efecto de la dosis y la dinámica del compromiso objetivo de KDM1A, en lugar de mediciones de efectos posteriores como las marcas de histonas y la expresión. Esta técnica se puede aplicar en la investigación básica y también en ensayos clínicos, en EL SNC oncológico u otras enfermedades sujetas al tratamiento con inhibidor de KDM1A para estudiar la farmacodinámica.
Esta técnica se basa en una quimioprobeba desarrollada para estudiar ORY-1001, iadademstat, pero se puede utilizar realmente para otros inhibidores de KDM1A y la estrategia se puede aplicar a otros objetivos. El procedimiento lo demostrará Raquel Ruiz, gerente de operaciones de la plataforma de descubrimiento PK/PD de mi laboratorio. Durante el tratamiento celular con ORY-1001 el compuesto se une a la proteína KDM1A presente en el núcleo.
Para comenzar este procedimiento, recupere de la nevera una alícuota de un solo uso de 10 microlitrolitios de 20 sondas biotiniladas mililitros de solución en stock y deje que se caliente a temperatura ambiente durante 10 minutos. Usando un micropipet con puntas de filtro, diluya en serie la solución de stock para preparar las dos soluciones de trabajo micromolares. A continuación, disolver un comprimido de inhibidor de la proteasa en un mililitro de PBS en un tubo de microcentrífuga.
Para cada mililitro del volumen deseado de tampón de lisis de 1 celda con la quimioprobeda, mezclar 100 microlitros de tampón de lisis de 10 células obtenido comercialmente, 150 microlitros del inhibidor de 10x proteasa, 12,5 microlitros de las dos micromolares OG-881 y 737,5 microlitros de agua doble destilada tipo 1. Las células se lisan en tampón de lisis 1x en presencia de la quimioprobada que se une a cualquier proteína KDM1A libre. Para prepararlos a partir de tejidos, utilice un mortero y un mortero que se enfríen sobre hielo seco para pulverizar y homogeneizar un pedazo de tejido congelado de un centímetro cúbico.
Aliquot el tejido en viales de un solo uso, asegurándose de transferir aproximadamente 40 miligramos de polvo de tejido en cada vial, evitando la descongelación en todo momento. Almacene las muestras a 80 grados centígrados hasta que estén listas para procesarse. Para preparar a partir de pellets celulares, resuspendir el pellet de aproximadamente 10 millones de células en 200 microlitros de tampón de 1x lisis celular que contiene 25 nanomolarES OG-881.
Vórtice cada muestra brevemente y mantenerlos en hielo durante cinco minutos. Usando un sonicador, sonicar las muestras con tres pulsos a 45 kilohercios que duran 20 segundos cada uno. Coloque las muestras sobre hielo durante 20 segundos entre pulsos.
Mantenga las muestras en hielo durante cinco minutos adicionales. Luego, el vórtice se retuerza brevemente y centrifuga las muestras a 14.000 veces G durante 10 minutos en una centrífuga que se enfría antes de los cuatro grados centígrados. Usando un micropipet de un mililitro transfiera cada sobrenadante en un tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitros.
Deje los tubos sobre hielo durante dos horas antes del procesamiento. A continuación, cuantifique la proteína nativa utilizando el ensayo de Bradford como se describe en el protocolo de texto. Una placa total está recubierta con anticuerpos anti-KDM1A.
La placa libre está recubierta con estreptavidina. El linsado celular se agrega a ambas placas y el complejo KDM1A se captura directamente o a través de la quimioprobada. Las placas se lavan e incuban con el anticuerpo de detección anti-KDM1A y un anticuerpo secundario acoplado a la peroxidasa de rábano picante.
Finalmente, se añade sustrato luminiscente y se genera la señal. Para el ELISA total de KDM1A, prepare 10 mililitros de anticuerpos de captura KDM1A en PBS a una concentración final de dos microgramos por mililitro para cada placa. Transfiera 100 microlitros a cada pozo de la placa.
Para KDM1A ELISA libre, preparar 10 mililitros de estreptavidina en PBS como una concentración de 10 microgramos por mililitro para cada placa. Transfiera 100 microlitros a cada pozo de la placa. A continuación, selle la parte superior de cada placa con película adhesiva e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados.
Al día siguiente, retire las placas del refrigerador y deje que se equilibren a temperatura ambiente durante aproximadamente 45 minutos. Lave cada plato tres veces con tampón de lavado, asegurándose de tocar la placa en toallas de papel después de cada paso de lavado para eliminar cualquier solución residual. Agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo a cada pozo de ambas placas.
Enscinda las placas con película adhesiva e incubar a temperatura ambiente durante dos horas. Mientras tanto, diluir los extractos de proteína nativa previamente obtenidos con PBS a la concentración adecuada y establecer la placa para preparar una curva estándar utilizando rKDM1A humana como se describe en el protocolo de texto. Una vez completada la incubación de dos horas, deseche el tampón de bloqueo y lave las placas con tampón de lavado, asegurándose de tocar la placa en toallas de papel después de cada paso de lavado para eliminar cualquier solución residual.
Transfiera las muestras diluidas apropiadas a un bloque de almacenamiento de pozos refrigerados de 96 aguas profundas siguiendo la distribución de la placa que se encuentra en la tabla dos del protocolo de texto. Mantenga este bloque sobre hielo mientras pipetea 100 microlitros por pozo en las placas ELISA totales y libres siguiendo la distribución de la placa que se encuentra en la tabla tres del protocolo de texto. Incubar a temperatura ambiente durante una hora, luego desechar las muestras y lavar las placas cinco veces con tampón de lavado.
Preparar 20 mililitros de anticuerpos anti-KDM1A de conejo en el tampón de bloqueo a una concentración de 0,125 microgramos por mililitro. Añadir 100 microlitros de la solución de anticuerpos de detección a cada pozo de ambas placas, excepto las correspondientes a los controles negativos. Enscinda las placas con película adhesiva e incubar a temperatura ambiente durante una hora.
Después de esto, deseche la solución de anticuerpos de detección y lave las placas seis veces con el tampón de lavado. Preparar 25 mililitros de anticuerpos anti-conejo de cabra secundario, HRP, a una dilución de uno a 5.000 en tampón de bloqueo. Añadir 100 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios a cada pozo de las placas de microtíter e incubar a temperatura ambiente durante una hora.
30 minutos antes del final de esta incubación, mezclar partes iguales de potenciador de luminol y solución de peróxido en una botella de ámbar en condiciones de luz suave. Deje esta mezcla a temperatura ambiente. Cuando se complete la incubación de una hora, deseche la solución de anticuerpos secundaria y lave las placas seis veces con el tampón de lavado.
A continuación, pipetear 100 microlitros de la solución de trabajo luminol a cada pozo de las placas, asegurándose de pipetear muy lentamente para evitar la formación de burbujas. Utilice un temporizador para controlar el tiempo entre la adición de la solución y la medición de luminiscencia de las placas y mantener este tiempo constante para lograr una buena reproducibilidad entre ensayos. Cierren las placas con película adhesiva y centrífuga a 500 veces G y a temperatura ambiente durante 45 segundos para eliminar las burbujas restantes.
Incubar las placas en una coctelera de placa a 100 rpm durante un minuto. A continuación, retire la película adhesiva e inserte la placa en un lector de microplacas y déjela durante tres minutos para estabilizar la temperatura a 25 grados centígrados. Lea las unidades de luminiscencia relativas de cada ensayo de placa ELISA.
Guarde y copie los valores RLU sin procesar de los archivos de hoja de cálculo de datos sin procesar para su posterior análisis. En este estudio, se utiliza un nuevo ELISA basado en la captura de quimioprobe de KDM1A para medir directamente el compromiso objetivo de KDM1A en células y muestras de tejido. Los valores RLU de rKDM1A total y libre se evalúan para verificar la linealidad.
Los valores RLU de KDM1A total y libre detectados en PBMC humanos de tres voluntarios independientes se superponen en la curva estándar. Las células AML se cultivan siguiendo las recomendaciones del proveedor y se tratan con vehículo u ORY-1001 a diferentes concentraciones. El extracto de proteína nativa se obtiene en presencia de 25 mililitros OG-881 quimioprobeo y 0,5 microgramos de proteína total se utiliza para realizar el análisis de compromiso objetivo.
A continuación, se determinan los KDM1A totales y libres y los porcentajes de participación objetivo de ORY-1001 a KDM1A se calculan en relación con el vehículo. Aquí se muestra el compromiso objetivo KDM1A con dosis sensible en PBMC y en el tratamiento pulmonar de ratas con ORY-1001 por gavage oral, calculado en relación con el grupo de vehículos. La incubación ex vivo con 25 ory-1001 nanomolares de extractos de proteína pulmonar de los animales tratados con vehículo, produce TE completa, sin embargo, pero no aumenta aún más la TE en muestras de ratas tratadas durante cuatro días con 30 microgramos por kilogramo DE ORY-1001, confirmando que KDM1A ya estaba completamente inhibido in vivo.
Este protocolo evalúa la contratación objetivo de KDM1A midiendo KDM1A libre y total. Recuerde que requiere extracción de proteínas nativas. Esta técnica se puede utilizar en muestras de diferentes especies para evaluar un inhibidor específico, también para detectar nuevos inhibidores.
La quimioprobeba utilizada en este estudio también se puede aplicar para la quimioproteómica para estudiar el interactum KDM1A. Recuerde trabajar con seguridad y respetar en todo momento las medidas preventivas al manipular muestras biológicas y compuestos bioactivos como el inhibidor de la KDM1A.
