Estos protocolos ayudarán a cualquier investigador a incorporar el uso de líneas celulares de Drosophila para impulsar o complementar su agenda de investigación. La mayoría si no todos los cultivos celulares de Drosophila reviven, proliferan y crio-preservan bien cuando se manejan de acuerdo con estas pautas. Después de limpiar la superficie de trabajo de una campana de flujo laminar con 70% etanol, dispensar cinco mililitros del medio apropiado en un matraz T cuadrado de 25 centímetros.
Limpie el recipiente de la línea celular congelada con 70%etanol y afloje cuidadosamente y despre cierre la tapa. Con una pipeta Pasteur, transfiera un mililitro de medio de temperatura ambiente del matraz al crio-vial y mezcle suavemente para descongelar las células congeladas. Teniendo cuidado de que la suspensión celular no se desborde, transfiera todo el volumen de la suspensión celular descongelada al matraz y enjuague el crio-vial con medio fresco.
Permita que las células se asienten en la parte inferior del matraz durante al menos dos horas en una incubadora de 25 grados centígrados. No devuelva las células congeladas que hayan sido empacadas para viajar de vuelta al congelador de menos 80 grados centígrados durante un período prolongado o en nitrógeno líquido. En su lugar, descongele las celdas lo antes posible.
Después de confirmar la fijación bajo un microscopio de luz, sustituya suavemente el sobrenadante con cinco mililitros de medio fresco antes de devolver el matraz a la incubadora. Alternativamente, después de descongelar, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros para centrifugación y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio fresco antes de sembrar en un matraz T-25 como acaba de demostrar. Para determinar si las células están listas para ser pasadas, examine la morfología y la confluencia del cultivo bajo un microscopio.
Teniendo en cuenta la densidad celular y el tiempo de duplicación, la última vez que las células fueron sub-cultivadas, y cualquier signo de contaminación microorganismo en el cultivo. Si el cultivo parece altamente confluente, utilice diez mililitros del sobrenadante de cultivo para desalojar suavemente las células del fondo de la placa de cultivo y determinar la densidad celular contando el número de células viables en la suspensión de una sola célula resultante. Sub-cultivo de las células si la densidad celular es entre cinco a diez veces diez a la sexta célula por mililitro en el medio adecuado.
Añadir al menos una vez diez a la sexta célula por mililitro de concentración en una nueva placa de cultivo para lograr la densidad de células de siembra deseada. A continuación, cubra y etiquete las placas con las iniciales del operador, la fecha, la relación de división, la densidad de la célula de siembra, el identificador de la línea celular, el medio, el número de pasaje y cualquier adición media, como antibióticos, y coloque las placas en un recipiente de plástico para su incubación continua en la incubadora de 25 grados centígrados. Para desalojar las células adherentes forman un fondo de plato de cultivo de 100 milímetros, primero transfiera todo el sobrenadante en un matraz estéril y enjuague las células con una adición lenta de un mililitro de 0.05%trypsin EDTA.
Gire suavemente para asegurarse de que la solución de tripsina cubra toda la superficie de crecimiento antes de descartar la solución. A continuación, agregue suavemente uno a dos mililitros de EDTA de 0,05% de trippsina fresca al plato y coloque el plato en la incubadora de 25 grados centígrados durante tres a diez minutos. Cuando se puede observar la capa celular desprendiéndose y deslizándose fuera de la superficie de crecimiento, detenga la actividad de la trippsina con la adición de nueve mililitros del sobrenadante guardado y mezcle la suspensión celular a fondo para disociar los grumos de la célula.
Cuando todas las células han sido desalojadas, la superficie de crecimiento será clara. Para contar manualmente las células usando un portaobjetos de células Neubauer, primero limpie la superficie de un portaobjetos hemocitociómetro y cubra el deslizamiento con 70% de alcohol. Después de mezclar, agregue 15 microlitros de las células en cada borde ranurado del hemocitometro para llenar ambas cámaras.
La suspensión celular se introducirá en la cámara de conteo por acción capilar. Usando un objetivo de microscopio 10x, cuente entre 100 a 200 celdas dentro del área cuadrada de un milímetro en el centro de la cuadrícula enlazada por las líneas paralelas. A continuación, repita la enumeración con la segunda cámara y utilice el promedio de los dos recuentos para determinar la densidad de celdas de acuerdo con la fórmula.
Para la criopreservación de la línea celular Drosophila, vuelva a suspender el pellet celular en un volumen de medio de congelación que dará lugar a una densidad celular final de al menos cuatro veces diez a las séptimas células por mililitro. Añadir un volumen adecuado del crio-protector, dimetilsulfóxido o DMSO, en la caída de la suspensión celular sabia de tal manera que la concentración final de DMSO es del 10% y mezcle suavemente la suspensión celular. A continuación, agregue cuidadosamente 0,5 mililitros alícuotas de la suspensión celular en crio-viales preetiquetados y coloque los crio-viales en un recipiente de congelación lleno de isopropanol.
A continuación, transfiera el recipiente de congelación a un congelador de menos 80 grados centígrados durante la noche para permitir que la temperatura de los crio-viales baje lentamente a la temperatura del congelador. A continuación, transferir rápidamente los crio-viales a bastones para su inserción en un recipiente de nitrógeno líquido. Alternativamente, transfiera los crio-viales congelados a una caja de congelación preenfriada y almacene los crio-viales congelados en la fase líquida de un congelador de nitrógeno.
La confluencia de una línea celular se puede determinar mediante un microscopio de luz. Las líneas celulares de rápido crecimiento que alcanzan la confluencia temprano deben ser descualadas regularmente, hasta dos veces por semana. Por el contrario, las células de crecimiento lento se pueden pasar al menos una vez cada dos semanas o más, aunque estas células necesitan ser alimentadas como medias frescas cada semana.
Las líneas celulares derivadas de diferentes fuentes de tejido difieren en su morfología, propiedades de adherencia, requisitos de medios y tiempos de duplicación. Para experimentos cuantitativos, el recuento celular es esencial. Las células se pueden contar utilizando un hemocicómetro o un contador de partículas automatizado.
La confluencia celular es una guía visual para cuándo someterse a la subcultura para el operador experimentado. Sin embargo, el conteo celular conduce a un cronograma de subculturismo predecible y facilita la detección de anomalías de crecimiento. Tenga cuidado y utilice el equipo de protección adecuado cuando trabaje con nitrógeno líquido.
