Diese Protokolle werden jedem Forscher helfen, die Verwendung von Drosophila-Zelllinien zu integrieren, um ihre Forschungsagenda voranzutreiben oder zu ergänzen. Die meisten, wenn nicht alle Drosophila-Zellkulturen beleben, vermehren sich und kryoerhalten gut, wenn sie nach diesen Richtlinien behandelt werden. Nach dem Abwischen der Arbeitsfläche einer laminaren Strömungshaube mit 70% Ethanol fünf Milliliter des entsprechenden Mediums in einen 25 Zentimeter quadratischen T-Kolben geben.
Den Behälter mit gefrorener Zelllinie mit 70% Ethanol abwischen und den Deckel vorsichtig lösen und entsiegeln. Mit einer Pasteur-Pipette einen Milliliter Raumtemperaturmedium vom Kolben auf die Kryo-Vial übertragen und sanft mischen, um die gefrorenen Zellen aufzutauen. Achten Sie darauf, dass die Zellsuspension nicht überläuft, übertragen Sie das gesamte Volumen der aufgetauten Zellsuspension auf den Kolben und spülen Sie die Kryo-Vial mit frischem Medium.
Lassen Sie die Zellen sich mindestens zwei Stunden lang in einem 25-Grad-Celsius-Inkubator am Boden des Kolbens nieder. Geben Sie gefrorene Zellen, die für die Reise verpackt wurden, nicht für einen längeren Zeitraum in einen Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius oder in flüssigen Stickstoff zurück. Tauen Sie stattdessen die Zellen ASAP.
Nach der Bestätigung der Befestigung unter einem Lichtmikroskop, ersetzen Sie den Überstand vorsichtig durch fünf Milliliter frisches Medium, bevor Sie den Kolben zum Inkubator zurückgeben. Alternativ, nach dem Auftauen, übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 Milliliter konisches Rohr für zentrifugieren und das Pellet in fünf Milliliter frisches Medium wieder aufhängen, bevor Sie in einen T-25-Kolben aussäen, wie gerade gezeigt. Um festzustellen, ob die Zellen für den Durchgang bereit sind, untersuchen Sie die Morphologie und den Zusammenfluss der Kultur unter dem Mikroskop.
Unter Berücksichtigung der Zelldichte und der Verdoppelungszeit wurden die Zellen das letzte Mal subkultiviert, und alle Anzeichen einer Mikroorganismuskontamination in der Kultur. Wenn die Kultur stark konfluent erscheint, verwenden Sie zehn Milliliter des Kulturüberstandes, um die Zellen sanft vom Kulturplattenboden zu entfernen und die Zelldichte zu bestimmen, indem Sie die Anzahl lebensfähiger Zellen in der resultierenden Einzelzellsuspension zählen. Subkultur der Zellen, wenn die Zelldichte zwischen fünf und zehn mal zehn bis sechs Zellen pro Milliliter im entsprechenden Medium liegt.
Fügen Sie mindestens ein mal zehn bis die sechste Zelle pro Milliliter Konzentration in einer neuen Kulturplatte hinzu, um die gewünschte Saatzelldichte zu erreichen. Bedecken und beschriften Sie dann die Platten mit den Operatorinitialen, Datum, Split-Verhältnis, Säzellendichte, Zelllinienkennung, Medium, Durchgangsnummer und allen mittleren Zusätzen wie Antibiotika, und legen Sie die Platten in Plastikbehälter für ihre fortgesetzte Inkubation im 25 Grad Celsius Inkubator. Um anhaftende Zellen zu entfernen, bilden Sie einen 100-Millimeter-Kulturschalenboden, übertragen Sie zunächst den gesamten Überstand in einen sterilen Kolben und spülen die Zellen mit einer langsamen Zugabe von einem Milliliter 0,05% Trypsin EDTA.
Wirbeln Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Trypsin-Lösung die gesamte Wachstumsfläche abdeckt, bevor die Lösung verworfen wird. Als nächstes, sanft ein bis zwei Milliliter frische0,05%Trypsin EDTA auf die Platte geben und die Platte in den 25 Grad Celsius Inkubator für drei bis zehn Minuten legen. Wenn die Zellschicht beobachtet werden kann, wie sie sich von der wachsenden Oberfläche löst und abrutscht, stoppen Sie die Trypsin-Aktivität mit der Zugabe von neun Millilitern des gespeicherten Überstandes und mischen Sie die Zellsuspension gründlich, um die Zellklumpen zu dissoziieren.
Wenn alle Zellen entfernt wurden, wird die wachsende Oberfläche klar sein. Um die Zellen mit einem Neubauer-Zellzählschlitten manuell zu zählen, wischen Sie zunächst die Oberfläche eines Hämozytometerschlittens ab und bedecken Sie den Schlupf mit 70 % Alkohol. Nach dem Mischen 15 Mikroliter der Zellen in jede gerillte Kante des Hämozytometers geben, um beide Kammern zu füllen.
Die Zellsuspension wird durch Kapillarwirkung in die Zählkammer gezogen. Mit einem 10-fachen Mikroskopobjektiv zählen Sie zwischen 100 und 200 Zellen innerhalb der Quadratfläche von einem Millimeter in der Mitte des Gitters, die durch die parallelen Linien gebunden ist. Wiederholen Sie dann die Aufzählung mit der zweiten Kammer und verwenden Sie den Durchschnitt der beiden Zählungen, um die Zelldichte gemäß der Formel zu bestimmen.
Für Drosophila-Zelllinie Kryo-Konservierung, re-suspendieren Sie das Zellpellet in einem Volumen von Gefriermedium, das zu einer endgültigen Zelldichte von mindestens vier mal zehn bis die siebten Zellen pro Milliliter führen wird. Fügen Sie ein entsprechendes Volumen des Kryo-Schutzmittels, Dimethylsulfoxid oder DMSO, in die Zellsuspension tropfen weise, so dass die endgültige DMSO-Konzentration 10% beträgt und mischen Sie die Zellsuspension sanft. Als nächstes 0,5 Milliliter Aliquots der Zellsuspension vorsichtig in vorbeschriftete Kryo-Fläschchen geben und die Kryo-Fläschchen in einen gefrierenden Behälter mit Isopropanol geben.
Dann den Gefrierbehälter über Nacht in einen Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius geben, damit die Temperatur der Kryo-Fläschchen langsam auf die Gefriertemperatur sinkt. Als nächstes, schnell die Kryo-Fläschchen auf Stöcke für das Einführen in einen flüssigen Stickstoffkanister übertragen. Alternativ können Sie die gefrorenen Kryo-Fläschchen in eine vorgekühlte Gefrierbox überführen und die gefrorenen Kryo-Fläschchen in der flüssigen Phase eines Stickstoffgefrierschranks aufbewahren.
Der Zusammenfluss einer Zelllinie kann durch Lichtmikroskop bestimmt werden. Schnell wachsende Zelllinien, die früh den Zusammenfluss erreichen, müssen regelmäßig, bis zu zweimal pro Woche, durchgesiedelt werden. Im Gegensatz dazu können langsam wachsende Zellen mindestens einmal alle zwei Wochen oder länger durchgedront werden, obwohl diese Zellen jede Woche mit frischem Medium gefüttert werden müssen.
Zelllinien, die aus unterschiedlichen Gewebequellen abgeleitet werden, unterscheiden sich in ihrer Morphologie, Ihren Hafteigenschaften, Medienanforderungen und Verdoppelungszeiten. Für quantitative Experimente ist die Zellzählung unerlässlich. Die Zellen können mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Partikelzähler gezählt werden.
Der Zellzusammenfluss ist ein visueller Leitfaden für die Subkultur für den erfahrenen Bediener. Die Zellzählung führt jedoch zu einem vorhersagbaren Unterkultivierungsplan und erleichtert die Erkennung von Wachstumsanomalien. Seien Sie vorsichtig und verwenden Sie die entsprechende Schutzausrüstung, wenn Sie mit flüssigem Stickstoff arbeiten.
