Las deacetilasas histonas de clase 1 como El RpdA se discuten como posibles dianas novedosas para el tratamiento de infecciones fúngicas. Sin embargo, las actividades enzimáticas purificadas son necesarias para la caracterización posterior. La principal ventaja de este protocolo es la separación rápida y suficiente de complejos nativos con etiquetas TAP para la determinación de la actividad en un solo paso.
Los complejos DE HDAC derivados de este protocolo se pueden utilizar para la detección de eficacia de nuevos inhibidores de la deactilasa específicos de hongos. Este método proporciona la base para la extracción y purificación de proteínas fúngicas etiquetadas por TAP, que podrían utilizarse como punto de partida para el establecimiento de protocolos para otras enzimas y cepas. Para comenzar este procedimiento, agregue 10 mililitros de CSS a cada matraz de conidia preparada.
Cierre bien cada matraz con la tapa de tornillo proporcionada y agite vigorosamente. Después de esto, utilice un bucle de inoculación estéril para raspar completamente cualquier conidia restante. Pasar la conidia a través de coladores celulares de 40 micrómetros colocados en un tubo de centrífuga y recoger la suspensión de cinco de los matraces en un tubo.
A continuación, centrifugar las muestras para combinar y diluir las muestras como se describe en el protocolo de texto. Primero coloque la tela de queso en un embudo en la parte superior de un matraz. Filtrar el micelio preparado a través del paño y lavar brevemente con agua desionizada.
Retire la mayor cantidad de humedad posible del micelio apretando la tela de queso entre sólo las manos y luego entre las toallas de papel. Después de esto, transfiera el micelio seco como láminas planas en un vaso de plástico con una tapa de tornillo. Usando nitrógeno líquido, congelar el micelio y almacenarlo en menos 80 grados Celsius antes de la liofilización.
Luego liofiliza el micelio de la noche a la mañana. Al día siguiente, detenga el proceso de liofilización cuando la temperatura del micelio permanezca constante. Retire los vasos y selle inmediatamente con las tapas de tornillo proporcionadas.
Primero agregue 1,5 gramos de micelio y una bola de molienda en el tarro de molienda de un molino de bolas. Moler el polvo micelial a 25 hercios durante 30 segundos y transferir el polvo micelial a un tubo centrífugo de 15 mililitros. Incline el tubo para permitir la posterior mezcla del micelio con el tampón, luego agregue seis mililitros de tampón de extracción en frío B250, incluyendo cóctel inhibidor de la proteasa 1X, por gramo de polvo micelial y mezcle con una pequeña espátula hasta lograr la homogeneización completa del extracto crudo;mantener el tubo en hielo durante cinco minutos.
A continuación, coloque el tubo y un tubo de equilibrio en una centrífuga y gire a 40.000 veces g y a cuatro grados centígrados durante al menos 20 minutos. Durante la centrifugación, establezca una columna de cromatografía desechable de 10 mililitros para comenzar a equilibrar la resina IgG. Pipetear 300 microlitros de resina IgG bien resuspendida en la columna.
Llene la columna a 10 mililitros con B250 y deje que el búfer fluya por gravedad. Añadir un mililitro de B250 incluyendo 1X cóctel inhibidor de la proteasa y dejar que fluya a través, a continuación, enchufar la parte inferior de la columna. Después de la centrifugación, retire 10 microlitros del sobrenadante para el análisis SDS-PAGE.
Coloque la muestra en un tubo de 1,5 mililitros que contenga 40 microlitros de agua y 12,5 microlitros de 5X LSB. Con una pipeta serológica, retire cuidadosamente el sobrenadante y transfiéralo a la columna que contiene las perlas de IgG equilibradas. Cierre la columna fijando firmemente la tapa del extremo proporcionada.
Para comenzar, incubar la columna de cromatografía en un mezclador rotativo a 10 rpm y a cuatro grados celsius durante dos a cuatro horas. Después de esto, quite la tapa y abra la columna en la parte inferior para recoger el flujo a través. Para lavar la columna, utilice una pipeta para añadir un mililitro de tampón de lavado 250 a la tapa de la columna para eliminar las perlas atrapadas y transferir esta suspensión en un solo color sobre la resina asentada para resuspend las cuentas.
A continuación, llene la columna hasta la parte superior con el búfer de lavado 250 y ciérrela con una tapa de pila conectada a una bomba peristáltica. Encienda la bomba peristáltica y ajuste la bomba a un caudal de aproximadamente uno a cinco mililitros por minuto, repita este proceso de lavado para un total de cuatro lavados, luego repita este proceso de lavado tres veces usando el tampón de equilibrio TEV. Cierre la columna de cromatografía en la parte inferior.
Resuspender las perlas de IgG en un mililitro de tampón de escote TEV y añadir 20 microlitros de cóctel inhibidor de proteasa 50X, así como 10 microlitros de TEV. A continuación tapa la columna e incubar en un mezclador rotativo a 10 rpm y a cuatro grados Celsius durante la noche para eluir los complejos proteicos unidos a través del HDAC etiquetado. Al día siguiente, abra la columna y recoja el eluido en un tubo centrífugo de dos mililitros.
Utilice 0,7 mililitros de tampón de escote TEV para eliminar las perlas de la tapa y para enjuagar la pared de la columna. Coloque el tubo centrífugo de dos mililitros en un tubo centrífuga de 50 mililitros y luego coloque la columna en el tubo abierto de dos mililitros. Transfiera todo este conjunto a una centrífuga de mesa y gire a 300 veces g durante dos minutos para obtener el eluido TEV.
En este estudio, se realiza un enriquecimiento de un solo paso de un HDAC de Clase 1 con etiqueta TAP del hongo filamentoso Aspergillus nidulans para la evaluación de la actividad deactilasa in vitro. Un resultado típico de esto ilustra claramente la eficacia del primer paso de afinidad, que se incrementa aún más al realizar la purificación en tándem. La mayoría de las proteínas prominentes presentes en el extracto de proteína y el flujo a través, sin embargo, ya están agotadas en el eluido TEV.
Un inmunoblot muestra señales fuertes que migran a aproximadamente 120 kilodatos correspondientes a RpdA de longitud completa con etiqueta CBP en el eluido TEV, el flujo de calmodulina y fracciones de eluido. Aquí se muestra un ensayo representativo de actividad deactilasa con el inhibidor específico de la HDAC Trichostatina A. La sensibilidad de la actividad confirma que los valores medidos se deben a RpdA y no son causados por una actividad proteasa inespecífica.
Esto es importante, ya que indica que la proteasa del TEV, que está presente a una concentración bastante alta, no interfiere con el ensayo de actividad del HDAC. Curiosamente, la actividad de HDAC se reduce significativamente después del segundo paso de purificación de afinidad, CE, en comparación con el eluido TEV. Con el fin de permitir la extracción eficiente de proteínas, asegúrese de que los micelios estén molido a polvo fino.
Esto es particularmente crítico cuando no hay ninguna máquina disponible y el mortero y el pestillo se utilizan para la molienda. La adición del segundo paso de afinidad al protocolo da como resultado fracciones lo suficientemente puras para la identificación de proteínas, pero realizadas en espectrometría de masas. Cuando trabaje con nitrógeno líquido, asegúrese de usar gafas de seguridad y guantes de protección para evitar lesiones personales.
