El objetivo general de este procedimiento experimental es la generación del virus del Zika recombinante infeccioso a partir de un clon de ADNc de longitud completa, ensamblado en un cromosoma artificial bacteriano bajo el control del promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano. El desarrollo de un sistema genético inverso para virus de ARN como el virus del Zika permite la manipulación directa del genoma del virus para estudiar múltiples aspectos de la biología viral y la patogénesis y desarrollar la estrategia de vacunas. La principal ventaja de esta técnica es que la construcción de un clon infeccioso del virus del Zika como un cromosoma artificial bacteriano supera la toxicidad asociada con el genoma del flavivirus y permite el rescate del virus infeccioso por transfección directa del clon de BAC cDNA en células susceptibles.
Esta metodología podría aplicarse a la construcción de clones de ADNn sobre zonas de servicio infecciosas estables y totalmente funcionales para otros flavivirus, así como otros virus de ARN de cadena positiva. Para comenzar este procedimiento, construya el clon cDNA del virus del Zika como se describe en el protocolo de texto, utilizando sitios de restricción apropiados. Cuatro fragmentos de ADN que abarcan el genoma del virus del Zika flanqueados por el promotor humano del CMV en el extremo cinco-prime y el ribosoma del virus del delta de la hepatitis y la terminación de la hormona de crecimiento bovina y secuencias de poliadenilación en el extremo tres-prime se ensamblan en un plásmido cromosómico artificial bacteriano.
En primer lugar, crecer una sola colonia de E.coli DH10B que lleva el clon infeccioso del virus pBAC-Zika en cinco mililitros de medio LB que contiene cloramphenicol durante ocho horas a 37 grados celsius con agitación suave. A continuación, añada 500 mililitros del medio LB que contenga cloranfenicol a un matraz de dos litros. Añadir un mililitro del cultivo bacteriano preparado al matraz y hacer crecer las células a 37 grados centígrados durante 14 a 16 horas hasta que el OD600 sea aproximadamente de 0,6 a 0,8.
Después de esto, utilice un kit comercial desarrollado específicamente para la purificación de BAC para purificar el clon de cDNA infección por BAC por lílisis alcalina siguiendo las instrucciones del fabricante. Un día antes de la transfección, placa Vero células en los pocillos de una placa de seis pocillos a una densidad de 500.000 células por pozo en medio de crecimiento. Para preparar la mezcla de transfección, agregue cuatro microgramos del clon de BAC cDNA a 250 microlitros de suero reducido medio y mezcle cuidadosamente.
En un tubo separado, diluir 12 microlitros del agente de transfección en 250 microlitros de suero reducido medio. Vórtice para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, combine el cDNA de BAC diluido con el agente de transfección.
Mezclar cuidadosamente e incubar a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Durante este período de incubación, utilice un medio de crecimiento sin antibióticos para lavar las células del Vero y dejar las células en un mililitro de medio fresco sin antibióticos. A continuación, distribuya los 500 microlitros del ADNc y la mezcla de reactivos de transfección en las células de Vero por gota.
Mece la placa de ida y vuelta para mezclar e incubar las células en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante seis horas. Después de esto, retire el medio de transfección y agregue dos mililitros de medio de crecimiento fresco con antibióticos. Incubar las células en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono, asegurándose de comprobar cada día la inducción del efecto citopático.
Después de cuatro a seis días de transfección, cuando el CPE es alrededor de 50 a 75%recoger los sobrenadantes de cultivo de tejido en tubos cónicos de 15 mililitros y centrífuga durante 10 minutos para eliminar los desechos celulares. Luego, cosecha los sobrenadantes que contienen el virus del Zika recombinante y desecha los gránulos celulares. Aliquot el sobrenadante en criotubos y guárdelos a menos 80 grados Celsius.
Para empezar, haga crecer las células de Vero al 90%de la confluencia. Lavar las células dos veces con PBS e infectarlas con el virus rescatado con la multiplicidad de infección de 0,1 en medio de crecimiento que contiene 2%FBS. Coloque las placas de las células en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono y roca cada 15 minutos durante el período de adsorción de 90 minutos.
Después de la adsorción viral, eliminar el inóculo viral y añadir medio de crecimiento fresco con 2%FBS. Incubar tres o cuatro días en las mismas condiciones utilizadas anteriormente. Cuando el CPE es aproximadamente 75%recoger el sobrenadante de cultivo de tejido y centrífuga para eliminar los desechos celulares.
Luego, cosecha el sobrenadante que contiene el virus del Zika recombinante y desecha el pellet. Aliquot el sobrenadante en criotubos. Coloque los tubos en una caja de congelación y guárdelos a menos 80 grados centígrados.
Cuando esté listo, retire una alícuota de virus del congelador y determine el título viral por ensayo de placa como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, se genera un clon estable y de longitud completa de la cepa del virus del Zika Rio Grande do Norte Natal mediante la clonación secuencial de cuatro fragmentos de ADNr superpuestos en el cromosoma artificial bacteriano pBeloBAC11 utilizando métodos de clonación convencionales y sitios de restricción únicos presentes en el genoma viral. Este clon de ADNc de longitud completa fue flanqueado en el extremo cinco-prime por el promotor humano del citomegalovirus para permitir la expresión de ARN viral en el núcleo de las células trans infectadas y en el extremo de tres primos por el ribosoma del virus del delta de la hepatitis seguido por la terminación de la hormona de crecimiento bovino y la secuencia de poliadenilación para producir ARN que contiene el extremo tres-prime exacto del genoma viral.
Una vez que se monta el cDNA de BAC, el virus infeccioso se puede recuperar fácilmente después de la transfección directa de células susceptibles de Vero con el clon de BAC cDNA utilizando liposomas catiónicos. Con este enfoque, el virus R zika RGN puede ser rescatado con títulos superiores a un millón de unidades formadoras de placas por mililitro. Además, el virus rescatado induce un claro efecto citopático y genera placas homogéneas de aproximadamente dos milímetros de tamaño.
La identidad del virus rescatado se confirma mediante un análisis de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo monoclonal específico para la proteína E del virus del Zika. En general, estos resultados demuestran que el virus del Zika recombinante infeccioso puede ser rescatado de clones de ADNc de longitud completa ensamblados en un BAC. En resumen, hemos desarrollado un potente enfoque genético inverso del virus del Zika basado en el uso de un cromosoma artificial bacteriano que podría adaptarse para generar las infecciones estables y funcionales con clon de ADNc de otros virus de ARN de cadena positiva para facilitar el estudio de la patología, desarrollar una vacuna, y facilitar la identificación de fármacos con actividad antiviral.
