Los autores desean agradecer a los miembros pasados ​​y presentes en la Adolfo García-Sastre y los laboratorios de Peter Palese para el desarrollo de la influenza técnicas de genética inversa y los plásmidos. La investigación en los laboratorios de AG-S está parcialmente financiado por CRIP, un centro financiado por el NIAID de Excelencia para la Investigación y Vigilancia de Influenza (HHSN266200700010C) y por las subvenciones NIAD R01AI046954, U01AI070469 y P01AI058113. La investigación en LM-S laboratorio está financiado parcialmente por el NIAID subvención RO1AI077719.

1. Virus de la gripe de rescate de la transfección Influenza A virus pertenece a la familia Orthomyxoviridae de cadena negativa virus ARN envuelto. La gripe A genoma del virus consiste en ocho diferentes genes de ARN de polaridad negativa que codifican, al menos, 11 proteínas virales (Figura 1) 4. Nos centraremos, en este informe, en el rescate de uno de la cepa de laboratorio más común, la gripe A/PR/8/34, 5 por medio de plásmidos ambisense (PDZ), que contiene los 8 segmentos de la gripe A/PR/8/34 viral ( Figura 2). Para el rescate de los virus de la influenza recombinante de ADN plásmido, se recomienda 3 transfecciones independientes para cada virus recombinante. Si más de un virus recombinante de rescate que se intenta, escala los siguientes pasos accordantly a la cantidad de virus para ser rescatados. La transfección siguientes y el protocolo de infección se ha establecido para los 6 y placas. Una representación esquemática del protocolo se ilustra en la Figura 3. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) mezcla: Preparar 250 ml del medio OptiMEM y 8.6 l de transfección por LPF2000. Se incuba durante 5-10 minutos a temperatura ambiente (TA). Mientras tanto, prepare la mezcla de transfección del plásmido. </li><li> Mezcla de transfección del plásmido: Prepare el coctel de la transfección de plásmidos en 50 l de los medios de comunicación OptiMEM. Por lo general, el uso de cada uno 1 mg de ADN plásmido por influenza rescate. Añadir 1 l de los plásmidos PDZ (a 1 mg / l) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, y NS a un tubo que contiene 50 l de los medios de comunicación OptiMEM. </li><li> OptiMEM-LPF2000 ADN plásmido mezcla: Añadir 250 l de paso 1.1 en la mezcla de ADN del plásmido de transfección de la gripe (paso 1.2). Incubar la mezcla durante 20-30 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, preparar suspensiones de células 293T y MDCK para la transfección. </li><li> Preparación de 293T/MDCK co-cultivo: Antes de comenzar, lleve el 1X PBS, DMEM 10% de SFB al 1% los medios de comunicación PS, y la mezcla de EDTA-tripsina a 37 º C. La densidad de las células deben estar en 80-90% de confluencia del día de la transfección. Por lo general, un plato de 100 mm confluente de 293T y un plato de 100 mm confluente de células MDCK se puede utilizar para 10-12 rescates. Vamos a utilizar 250 l de células por pocillo. Ambas líneas celulares se resuspendieron en un total de 3 ml de DMEM 10% de SFB 1% PS. <ul><li> Cuidadosamente resuspender cada línea celular en 10 ml de DMEM 10% de SFB 1% PS en un tubo de centrífuga de 15 ml. Usted tendrá un tubo de células 293T y un tubo de células MDCK. </li><li> Resuspender las células 293T en 3 ml de DMEM 10% de SFB 1% PS, y cuando volvieron a suspender, entregar el 3 ml a las células MDCK para volver a suspender las células. Esto le dará la mezcla de células MDCK y 293T que se utilizará para sus compañeros de la cultura. </li><li> Añadir 250 l de las células 293T/MDCK por pozo (10-12 de 6 y pozos). </li></ul></li><li> Después de 20-30 minutos de incubación RT (paso 1.3), añadir 1 ml de DMEM 10% de SFB 1% PS a la mezcla de OptiMEM-LPF2000-influenza ADN del plásmido. </li><li> Agregue el 1,3 ml (paso 1.5) en los pozos con el 250 l de células 293T/MDCK (paso 1.4). </li><li> Agite con cuidado el 6-y-placa y dejar que la transfección de incubar durante la noche (ON) en la incubadora a 37 ° C y CO 2 al 5%. </li><li> Al día siguiente, aproximadamente 16-24 horas después de la transfección, cambiar el soporte de la transfección y se incuban las células transfectadas en Buenos Aires DMEM 0,3% al 1% PS con 1 mg / ml de TPCK-tripsina durante 48 horas. </li><li> A las 48 horas del cambio de los medios de comunicación, la transferencia del sobrenadante de las células transfectadas en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar el sobrenadante de cultivo de tejidos en una microcentrífuga durante 1-2 minutos, 13.000 rpm. </li><li> Infectar nuevas células MDCK en placas de 6 pocillos (plateado el día antes) o 10 días de edad huevos embrionados de pollo con 200 l de centrifugado sobrenadantes de cultivo de tejidos a partir del paso 1.10. Se incuban las células y / o los huevos a 37 ° C durante 2-3 días. <ol><li> La infección de los huevos de pollo de 10 días de edad embrionados: Todos los procedimientos para infectar los huevos de gallina embrionados se llevan a cabo en condiciones estériles. <ol><li> Vela los huevos de 10 días de edad, con una caja de luz, mirar al trasluz para ver la interfaz entre la cámara de aire y de la cavidad alantoidea. Haga una marca de lápiz en la frontera de la interfaz. </li><li> Con una aguja de la jeringa de 5 ml hacer un agujero en la cáscara del huevo. </li><li> Con una jeringa de 1 ml, infectan cada huevo con 200 l de los sobrenadantes de cultivo de tejidos a partir del paso 1.10. </li><li> Cubrir el agujero en la cáscara del huevo con cera fundida utilizando un hisopo de algodón. </li><li> Incubar los huevos infectados en 37οC durante 2-3 días. </li></ol></li><li> La infección de nuevas células MDCK: El día antes de la aprobación del sobrenadante del cultivo de tejido de la 293T/MDCK co-cultivos, prePare de 6 pocillos placa con células MDCK para llegar a 80-90% de confluencia día siguiente. Por lo general, un confluente 100 mm placa de cultivo de tejidos se puede dividir en 6-8 pozos. Lavar las células dos veces con PBS 1X, trypsinize y preparar las placas de 6 pocillos. Agite suavemente con la mano las placas con el fin de tener una distribución uniforme de las células. Cultivo de las células, ON, en la incubadora de 37 ° C, 5% de CO 2. Antes de la infección, consulte las células bajo el microscopio para confirmar una monocapa, y luego, proceder a la infección: <ul><li> Lavar las células dos veces con 1 ml de PBS 1X. </li><li> Infectar con el l 200 de centrifugado sobrenadantes de cultivo de tejidos durante 1 hora a temperatura ambiente. No deje que las pilas secas. Rock the 6-y-placa cada 10 minutos. </li><li> Después de 1 hora de la absorción viral, retire el soporte de la infección de las células MDCK y añadir 2 ml de DMEM BA 0,3% al 1% PS con 1 mg / ml de TPCK-tripsina. </li><li> A las 48-72 horas después de la aprobación, en función de la eficiencia de transfección y la carga viral, un efecto citopático (CPE) se observó en las células infectadas MDCK. CPE propone un rescate exitoso. Sin embargo, un ensayo de HA (sección 2), aún se debe realizar para confirmar la presencia del virus en el sobrenadante de cultivo de tejidos. </li></ul></li></ol></li><li> Fluido alantoideo de cosecha de huevos de gallina embrionados infectados: Todos los procedimientos para la cosecha del líquido alantoideo de los huevos infectados se llevan a cabo en condiciones estériles. Aproximadamente 8-12 ml de fluido alantoideo se puede cosechar a partir de cada huevo de 10 días de edad por el VIH. Antes de la recolección del líquido alantoideo, se incuban los huevos de gallina durante 2 horas (u ON) a 4 ° C para matar a los embriones de pollo y la coagulación de la sangre. <ul><li> Lave las cáscaras de huevo con etanol al 70% para establecer las condiciones de esterilidad. </li><li> Abrir el huevo, con cuidado, sobre la cavidad de aire golpeando con una cuchara. Retire la cáscara de huevo roto con la ayuda de fórceps. </li><li> Con una aguja de 1 ml, quitar la membrana alantoidea sin romper la yema del huevo. </li><li> Estabilizar el embrión de pollo con una espátula en la conducción de una pipeta de 10 ml en el líquido alantoideo. Recoger la mayor cantidad de líquido alantoideo como sea posible en un tubo de centrífuga de 15 ml en hielo en un cubo de hielo sin romper o el cobro de cualquiera de la yema del huevo. Utilizar un tubo de centrífuga de 15 ml por cada huevo. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 4 ° C y la transferencia del líquido alantoideo (sin gránulos de glóbulos rojos) a un nuevo tubos de 15 ml centrífuga. </li><li> Guarde los tubos que contienen el líquido alantoideo se centrifuga a 4 ° C hasta que se comprueba la presencia de virus rescatado con una hemaglutinación (HA) de ensayo. </li></ul></li></ol> 2. HA ensayo para confirmar el rescate de los virus de la influenza recombinante Ensayo de hemaglutinación (HA) se utiliza rutinariamente para detectar la presencia de virus rescatado en MDCK sobrenadantes de cultivo de tejidos y / o el líquido alantoideo de los huevos cosechados. Por otra parte, los ensayos de inmunofluorescencia (IFA) también se puede ajustar. Una vez que un ensayo identifica la presencia de virus rescatado, el virus se purificaron en placa y la composición genética del virus se confirmó mediante RT-PCR y secuenciación. La presencia del virus en el sobrenadante de cultivo de tejidos MDCK y / o en el líquido alantoideo de los huevos infectados se puede determinar macroscópicamente con HA de pollo (u otra fuente) los glóbulos rojos (RBC). La presencia del virus induce hemaglutinación de glóbulos rojos, mientras que la ausencia de virus permite la formación de una bolita roja en el fondo del pozo (Figura 4). En el caso de los virus de la influenza, se cree que aproximadamente 10 3 -10 4 unidades formadoras de placas (UFP) están obligados a dar una señal positiva en el ensayo de HA, por lo tanto, una alternativa de huida se puede realizar en paralelo con el ensayo de hemaglutinación para confirmar un resultado negativo verdadero. IFA con primaria de anticuerpos anti-influenza es más sensible que la prueba de HA, ya menos de 103 a 104 virus puede ser detectado con esta técnica. Es posible que los sobrenadantes o fluidos alantoideo que HA-negativos son positivos por el IFA. En este caso, el virus debe ser amplificada por pases, de nuevo, en células MDCK o en huevos. Fluido alantoideo y / o sobrenadantes de cultivo de tejidos a partir de ahora el segundo paso debe ser claramente positivos en el ensayo de HA. HA ensayos se llevan a cabo en el fondo en V de 96 pocillos. Negativos (por ejemplo, PBS 1X) y positivos (sobrenadantes de cultivo de tejidos y / o fluido alantoideo de una infección de virus de la influenza) muestras de control siempre debe ser incluido en cualquier ensayo de HA para validarlo. <ul><li> Dispensar 50 l de PBS 1X a cada pocillo de la V-96 pocillos de fondo de placa. </li><li> Añadir 50 l delos sobrenadantes tejido MDCK cultura y / o fluido alantoideo de los huevos infectados con el primer pozo y hacer 2 veces diluciones seriadas de los pozos siguientes. Deseche el extra de 50 l en el pozo pasado. </li><li> Añadir 50 l de 0,5% -1,0% de células rojas de la sangre de pollo (preparado en PBS 1X) a cada pocillo. </li><li> Incubar el fondo en V de 96 pocillos durante 30-45 minutos (hasta un punto rojo es visible en la parte inferior de un control negativo de la muestra PBS) sobre el hielo. Lea y interpretate los resultados como se indica en la Figura 4. </li></ul> 3. La aprobación de sobrenadantes de cultivo de tejidos Un resultado negativo en la prueba de HA puede ser el resultado de la baja eficiencia de transfección con bajos niveles de virus presente que en los sobrenadantes de cultivo de tejidos y / o fluido alantoideo. La aprobación de estas muestras de huevos frescos MDCK y / o embrionados permite la amplificación del virus (como se indica en la Figura 3) Las infecciones se llevan a cabo como se describió anteriormente en la sección 1.11.2. 4. Resultados representante Rescate con éxito el virus de la gripe se confirma por la presencia de un ensayo de HA positivo (Figura 4). Además, la existencia de ECP en las células infectadas con el sobrenadante de cultivo de tejidos o con el fluido alantoideo de los huevos se sugiere un rescate viral positiva. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Estructura virus de la gripe: el virus de la gripe está rodeado por una bicapa lipídica que contiene dos glicoproteínas virales (HA, NA) y, también, la proteína del canal de iones, M2. HA es la proteína de unión del virus, responsables de la unión de ácido siálico, que contienen los receptores. NA es responsable de la liberación viral de las células huésped. Por debajo de la bicapa lipídica, es una capa de proteína compuesta por la proteína de la matriz sobre una superficie interior, M1, que desempeña un papel en virión montaje y en ciernes y la proteína nuclear de exportación (NEP), necesarios para la exportación nuclear de ribonucleocapsids viral. El núcleo del virus es de una ribonucleoproteína (RNP) compleja, compuesta de 8 de cadena simple negativa genes ARN viral encapsulada por la nucleoproteína viral, NP. Asociadas con el complejo RNP son los virus de ARN dependiente de ARN polimerasa subunidades PA, PB1, PB2 y. Las proteínas no estructurales, NS1 y PB1-F2, codificado por el ARN segmentos NS y PB1, respectivamente, no son parte de la estructura del virión. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Influenza virus de rescate plásmidos: Los genes de la gripe ocho virus clonado en el plásmido PDZ ambisense se indican. plásmido PDZ 6, deriva de la expresión de la proteína del plásmido pCAGGs 7, es un vector plásmido bidireccional con un ser humano la RNA polimerasa I promotor y una secuencia de terminación de ratón que codifica el ARN genómico de sentido negativo, en orientación opuesta a la de la polimerasa que se unen, una polimerasa II cassette de transcripción (pollo β-actina promotor y poliA) codifica las proteínas del virus del gen viral mismo. ADNc de cada segmento viral son generados por RT-PCR con cebadores directo e inverso que contiene la restricción endonucleasa Sapi sitio y las regiones no codificadoras de cada segmento (cajas de negro en el extremo de los genes virales). El producto de PCR se clona en el PDZ digerido con Sap-I. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. De ocho a base de plásmidos influenza sistema de rescate: los plásmidos PDZ que contienen los genes 8 influenza viral son co-transfectadas, en suspensión, en las células MDCK-293T co-culturas (día 1). Veinticuatro horas después de la transfección, los medios de comunicación sin FBS, pero que contiene TPCK / tripsina se sustituye (día 2). Cuarenta y ocho horas después de cambiar los medios de comunicación, el sobrenadante de cultivo de tejidos se extrae y se usa para infectar los huevos embrionados MDCK o 10 días de edad-de pollo (día 4). 48-72 horas después de la amplificación, los sobrenadantes de cultivo de tejidos de las células infectadas MDCK o fluido alantoideo de los huevos se cosechan y se analizó la presencia de virus de HA (día 6). Si no se detecta virus, los sobrenadantes misma y / o fluidos alantoideo puede volverse a inocular en nuevas células MDCK y / o huevos embrionados. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Hemaglutinina ensayo (HA): hemaglutinación de glóbulos rojos por partículas de virus es visible macroscópicamente y es la base para detectar partículas virales en los sobrenadantes de cultivo de tejidos y / o fluidos alantoideo. Aunque el ensayo de HA no discrimina entre las partículas virales que son infecciosas y las partículas que son degradados y ya no es capaz de infectar las células, el ensayo es un buen indicador de la presencia del virus en las muestras. A) Ausencia (arriba) de la presencia (inferior) del virus en las muestras biológicas se determina por la presencia de glóbulos rojos en la parte inferior de la placa o su ausencia, respectively. B) Un resultado representativo de un ensayo de HA con niveles no detectables de virus (arriba) o presencia (inferior) del virus de la muestra.

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	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

Mount Sinai School of Medicine tiene derechos de propiedad intelectual en el ámbito del virus de la influenza recombinante, y AG-S es un inventor de esta propiedad intelectual.

Rescate de los virus de la influenza recombinante de ADN plásmido es un proceso simple y sencillo una vez que el protocolo se realiza rutinariamente en el laboratorio, pero en un principio, varias cosas pueden salir mal. Es imprescindible tener una buena preparación de plásmidos para generar el virus. El mantenimiento adecuado de las líneas celulares (293T y MDCK) es crucial para el éxito de un rescate viral. Tradicionalmente, un marcador genético se inserta en un gen que codifica la gripe plásmido, mediante muta...

Las líneas celulares 293T (número de catálogo CRL-11268) y MDCK (número de catálogo CCL-34) líneas de células se mantienen en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 en DMEM 10% FBS, 1% de PS. Las células se forman a disposición de la American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 EE.UU.). Huevos embrionados de pollo Embrionados de 10 días de edad, los huevos de gallina se puede obtener de los Laboratorios Charles River, específico de abastecimiento patógeno aviar Fee (SPAFAS) Productos y Servicios aviar. Franklin Commons, 106 Ruta 32, North Franklin, CT 06254 EE.UU.. Los huevos se incuban a 37 ° C antes y después de la infección viral. Antes y después de la infección viral, los huevos son trasluz para determinar la viabilidad de los embriones. Es muy importante para buscar los huevos muertos, antes y después de la infección viral. Antes de la infección de un huevo muerto puede ser fácilmente identificables por la ausencia de vasos sanguíneos, así como la falta de movilidad del embrión. Al trasluz, los embriones vivos se mueven. Después de la infección viral de un huevo muerto (probablemente relacionada con la infección por virus de la gripe) se puede divisar por el mal aspecto de los huevos como se ve por el menor volumen y sangrienta de fluido alantoideo. Infectados con huevos son descartadas en doble bolsa de autoclave y autoclave siguiendo los procedimientos estándar. Células de pollo de glóbulos rojos (RBC) RBC de pollo se pueden comprar en las granjas Truslow, 201 Valley Road, Chestertown, MD 21620. Almacenar a 4 ° C. Para los ensayos de HA, lavado de 5 ml de RBC de pollo con 45 ml de PBS 1X en un tubo de centrífuga de 50 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpm, RT. Descartar cuidadosamente el sobrenadante y el uso de una dilución 1:1000 de los pellets de glóbulos rojos en PBS 1X (concentración final de 0.5 a 1.0% de glóbulos rojos). Sobrenadantes de cultivo de tejidos y fluidos alantoideo Tanto, los sobrenadantes de cultivo de tejidos y fluidos alantoideo se puede almacenar a 4 ° C por un período corto de tiempo. Después de confirmar rescate de virus, los virus de sobrenadantes de las células o el líquido alantoideo se almacenan a -80 ° C. Plásmidos Todos los plásmidos se preparan con las recomendaciones de un kit de plásmido maxi fabricante siguiente. Todos los plásmidos son alícuota en concentraciones de 1 mg / ml en ddH2O y almacenadas a -20 ° C. Para almacenamiento a corto plazo, el plásmido se puede mantener a 4 ° C. La concentración del ADN plásmido purificado se determina por espectrofotometría a 260 nm, con la pureza que se calcula utilizando la relación de 260:280 nm. Preparaciones a 1,8-2,0 260:280 nm ratios se consideran apropiados para fines de salvamento virus. Además, la concentración de plásmido y la pureza debe ser confirmada con la cromatografía en gel de agarosa. Ambisense PDZ plásmidos (6) que contiene los ocho genes virales de la gripe A/PR/8/34 (7) se ilustra en la Figura 2. Virus El protocolo descrito para el rescate de la gripe A/PR/8/34 se puede realizar bajo nivel de bioseguridad (BSL) 2 condiciones. Material contaminado, incluyendo los sobrenadantes de cultivo de tejidos y los huevos embrionados, deben ser esterilizados antes de su eliminación. Rescate de otros virus de la influenza puede requerir mayores condiciones BSL y, por tanto, las condiciones especiales / medidas de seguridad tendrá que ser seguido. Medios de cultivo y soluciones DMEM 10% de SFB 1% PS: 445 ml de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), 50 ml de suero fetal bovino (FBS), y 5 ml de 100X penicilina / estreptomicina (PS). Almacenar a 4 ° C. Este medio se utiliza para mantener las células 293T y MDCK, así como para las transfecciones. DMEM 0,3% BA 1% PS: 495,7 ml de DMEM, 4,3 ml de 35% de albúmina bovina (BA). Almacenar a 4 ° C. Justo antes de su uso, agregar la tripsina TPCK tratada a una concentración final de 1 mg / ml. Los medios de comunicación infecciosas. Fosfato de 10 veces (PBS): 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 2 g de KH 2 PO 4. Añadir ddH2O hasta 1 litro. Ajustar el pH a 7.3. Esterilizar en autoclave. Conservar a temperatura ambiente. 1X PBS: Diluir 10 veces con PBS 1:10 ddH 2 O. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

Los esfuerzos realizados por varios grupos de investigación de la gripe han sido fundamentales en el desarrollo y la mejora genética de la influenza A virus inversa. Originalmente establecida en 1999<sup&gt; 1,2</sup&gt; Plásmido basado en técnicas de genética inversa para generar virus recombinantes han revolucionado el campo de la investigación de la gripe debido a cuestiones específicas han sido contestadas por la ingeniería genética, los virus infecciosos de la gripe recombinante. Estos estudios incluyen la replicación del virus, la función de las proteínas virales, la contribución de las mutaciones específicas en las proteínas virales en la replicación viral y / o patogénesis y, también, los vectores virales con virus recombinantes que expresan proteínas extrañas influenza<sup&gt; 3</sup&gt;.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Rescate de virus de gripe A a partir del ADN plásmido es una técnica experimental básica y esencial que permite a los investigadores de la gripe para generar virus recombinantes para estudiar múltiples aspectos de la biología de los virus de la influenza, y para ser utilizado como vectores potenciales o vacunas.

Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

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Research

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Immunology and Infection

30.2K vistas.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Rescate de virus de gripe A a partir del ADN plásmido es una técnica experimental básica y esencial que permite a los investigadores de la gripe para generar virus recombinantes para estudiar múltiples aspectos de la biología de los virus de la influenza, y para ser utilizado como vectores potenciales o vacunas.

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Investigación

Inmunología e Infección

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purificación por afinidad de los complejos de ribonucleoproteína Influenza Virus de la cromatina de las células infectadas

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Rescate del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante a partir de cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

Expresión de funcionales recombinante hemaglutinina y neuraminidasa Proteínas del Virus Novel H7N9 Influenza usando el sistema de expresión de baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Propagación del virus de la influenza en embrionados de pollo Huevos

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Generación de recombinante humano IgG anticuerpos monoclonales a partir de células inmortalizadas B Ordenada

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-inmunoprecipitación de la proteína de ratón Mx1 con la Influenza A nucleoproteína del virus

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Nasal Toallitas para Influenza A Detección de Virus y aislamiento de los cerdos

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro El desmontaje de virus de influenza A cápsides por centrifugación en gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

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Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido