El ensayo ddTRAP proporciona la capacidad de obtener una medición sensible, robusta y altamente cuantitativa de la actividad enzimática de la telomerasa en las células. La capacidad de ejecutar hasta 96 muestras por ejecución de forma mediana nos ofrece una gran ventaja. Podemos ejecutar los controles y réplicas para un análisis estadístico adecuado de los datos recopilados.
Inmediatamente antes de la eleje de la célula, descongele una alícuota congelada del búfer de lelisis NP-40. Una vez descongelado, coloque el tampón de lelisis sobre hielo. Añadir inhibidor de la proteasa de PMSF al tampón de la lelisis NP-40 para alcanzar una concentración final de 0,2 milimolares.
Luego, agregue 40 microlitros del tampón de lysis al tubo que contiene un pellet celular para alcanzar una equivalencia celular de 25.000 células por microlitro. Pipetee suavemente el izado hacia arriba y hacia abajo para romper las celdas. Trate de evitar hacer burbujas.
Deje que las células se licen sobre hielo durante 30 minutos. A vórtice suavemente el licate cada 10 minutos para evitar que se formen racimos de desechos celulares. Durante la lelisis celular, prepare una mezcla maestra en un tubo de microcentrífuga para la reacción de extensión de la telomerasa y guárdelo en hielo.
Después de la lelisis celular, pipeta 48 microlitros de extensión master se mezclan en cada tubo PCR. Añadir dos microlitros de izado diluido a cada tubo pcR para alcanzar una equivalencia celular final de 50 células por microlitro, y continuar la reacción de extensión de la telomerasa según el manuscrito. Prepare una mezcla maestra en un tubo de microcentrífuga para el ddTRAP y manténgalo a temperatura ambiente.
Pipetear 19,8 microlitros de ddPCR mezcla maestra en cada tubo PCR. Añadir 2,2 microlitros de la solución de reacción de extensión anterior a cada tubo, dejando un volumen total de 22 microlitros. Para configurar el cartucho de generación de gotas, primero cargue 20 microlitros de la solución preparada en el pozo de muestras centrales en el cartucho.
Toque suavemente el lado del cartucho para mover cualquier burbuja a la parte superior de la solución. Todos los pozos del cartucho deben cargarse con muestra antes de cargar el aceite. A continuación, cargue 70 microlitros de aceite de generación de gotas en el pozo de aceite izquierdo.
Fije la junta en su lugar atándola a los extremos del cartucho y coloque el cartucho cargado y montado en el generador de gotas. El generador muestra una luz verde sólida para informar que el cartucho se coloca correctamente. Después de 60 a 90 segundos, cuando la luz del generador deja de parpadear, el ciclo se completa.
Ahora retire el cartucho. Retire suavemente la junta del cartucho. Utilice una pipeta multicanal para pipetear aproximadamente 40 microlitros de las gotas recién generadas desde el pozo derecho en una placa PCR de 96 pozos.
Selle la placa con sellos de placa PCR de papel de aluminio una vez que todas las muestras se cargan en la placa de 96 pocillos para evitar la evaporación. A continuación, cargue la placa de 96 pozos en un termociclador para realizar la reacción PCR. Para empezar, cargue la placa de 96 pozos en el lector de gotas.
Oriente la placa correctamente para que la muestra A1 coincida con la del soporte. Abra el software asociado con el lector de gotas. Haga doble clic en el primer pozo, A01, para abrir la pantalla del editor de pozos de muestra.
Haga clic en Experimento y seleccione el tipo de ensayo que se utilizará en el menú desplegable. Seleccione QX200 ddPCR EvaGreen Supermix como el método de detección correcto. Haga clic en Aplicar en la parte inferior derecha de la pantalla del editor de pozos para guardar la configuración definida por el usuario en todos los pozos resaltados.
A continuación, haga clic en Destino en la pantalla del editor de pozos y haga clic en el menú desplegable Destino para seleccionar el control desconocido, de referencia o sin plantilla para definir el tipo de muestra. En la sección Nombre de ejemplo, etiquete todos los ejemplos y haga clic en Aplicar. Haga clic en Ejecutar para leer la placa.
Seleccione Columnas o Filas en la pantalla Opciones de ejecución cuando se le solicite informar sobre la orientación en la que se debe leer la placa. Determine el número de gotas aceptadas para cada muestra haciendo doble clic en los pozos individuales o encabezados de columna y fila para proporcionar una tabla de información. Para el ddTRAP, las muestras con 10.000 o más gotas aceptadas son válidas para su posterior análisis.
Resalte los pozos que representan réplicas de muestra y muestras de NTC. Establezca manualmente el umbral para las muestras haciendo clic en el icono para establecer umbrales en la parte inferior izquierda de la pantalla. En este protocolo, la actividad de la telomerasa se midió en un panel celular compuesto por nueve líneas celulares de cáncer de pulmón y fibroblastos negativos de telomerasa.
Se estableció un umbral en alrededor de 2.000 de amplitud de fluorescencia para las tres réplicas biológicas para SHP77, H2887 y NTC. Las gotas positivas tenían una intensidad de fluorescencia alrededor de 6.000 de amplitud de fluorescencia, que formaban una población clara en la parte superior, y se separaban de las gotas negativas alrededor de 1.100 amplitudes de fluorescencia. Los productos de extensión total de telomerasa por equivalente celular entre todas las muestras se estimaron a partir de la concentración medida de los ácidos nucleicos, lo que representa la actividad de la telomerasa en las líneas de cáncer de pulmón.
Cualquier contaminación por ARNase durante los pasos de la lesis o de la reacción de extensión destruirá la actividad enzimática de la telomerasa, ya que es un complejo ribonucleoproteína. ddTRAP se puede seguir con ddPCR en los niveles de expresión de hTERT mRNA en la célula. Los dos conjuntos de datos nos permiten correlacionar la expresión de hTERT con la actividad de la telomerasa y profundizar en posibles mecanismos reguladores de la telomerasa, como el empalme alternativo.
Podemos explorar las manipulaciones a factores de empalme específicos y sus efectos en la actividad de la telomerasa. Actualmente, estamos diseñando moduladores de empalme de oligonucleótidos como fármacos potenciales dirigidos a la actividad telomerasa.
