Este protocolo presenta un flujo de trabajo pcR de gotas multiplexivas flexible que permite el recuento preciso de leucocitos diferenciales basados en marcadores epigenéticos de metilación. Esta flexibilidad puede facilitar la traducción de mdPCR hacia el uso clínico. Este método proporciona resultados que consultan estrechamente a los obtenidos mediante métodos de tinción inmunofluorescente.
Sin embargo, a diferencia de las tinciones inmunofluorescentes, este método no requiere muestras de sangre fresca ni anticuerpos costosos. En el diagnóstico hematológico, el leucocitos diferenciales puede servir como indicadores para un espectro de enfermedades, incluyendo infección, inflamación, anemia y leucemia, y está siendo considerado como un biomarcador de cáncer de pronóstico temprano. Demostrando el procedimiento con Abdelrahman Elmanzalawy estará Christina Nassif, una oficial técnica de nuestro equipo en el Centro de Investigación de Dispositivos Médicos de la NRC.
Comience mezclando a fondo 20 microlitros de proteína quinasa K y 400 microlitros de tampón de unión a la lesis que contiene perlas magnéticas con células mononucleares de sangre periférica humana recién descongeladas en 100 microlitros de PBS. Después de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, coloque el tubo en un bastidor magnético durante uno o dos minutos antes de retirar el sobrenadante. Con el tubo extraído del imán, vuelva a suspender el complejo de cuentas de ADN en 600 microlitros de tampón de lavado uno para eliminar cualquier perla no específicamente ligada.
Coloque el tubo de nuevo sobre el imán para permitir la extracción del sobrenadante, antes de lavar las células en 600 microlitros de tampón de lavado dos como se acaba de demostrar. Después de retirar el sobrenadante, deje que el tubo se seque al aire en el imán durante un minuto antes de agregar 100 microlitros de tampón de elución al tubo con una mezcla completa. A continuación, coloque el tubo en el bastidor magnético durante uno o dos minutos para separar las cuentas magnéticas del ADN aludido, y transfiera la solución de ADN purificado a un nuevo tubo.
Para la conversión de bisulfito del ADN purificado, transfiera 20 microlitros de la muestra de ADN aludido a un tubo pcR y agregue 130 microlitros de reactivo de conversión al tubo. Después de una mezcla exhaustiva, gire brevemente hacia abajo el contenido del tubo y amplificar el ADN en un ciclo térmico. Al final del ciclo, agregue 600 microlitros de búfer de unión a una columna de cromatografía iónica colocada en un tubo de recolección y agregue el ADN a la columna.
Invierta el tubo varias veces para mezclar y centrifugar durante 30 segundos a toda velocidad. Deseche el flujo recogido a través y agregue 100 microlitros de tampón de lavado a la columna. Centrifugar la columna y desechar el flujo a través de nuevo como se ha demostrado.
Añadir 200 microlitros de Desulfonation Buffer a la columna para una incubación de 15 a 20 minutos a temperatura ambiente, antes de centrifugar la muestra y descartar el flujo a través como se ha demostrado. A continuación, lave la columna dos veces con 200 microlitros de tampón de lavado por lavado. Después del segundo lavado, transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección de 1,5 mililitros y agregue 100 microlitros de agua de grado PCR a la membrana de la columna.
Luego, eluda el ADN por centrifugación de la columna durante un minuto a toda velocidad. Para la generación de gotas, mezcle un microlitro de ADN convertido en bisulfito con una mezcla maestra de sonda recién preparada en un tubo de PCR y recoja la muestra con una breve centrifugación. Utilice accesorios de pico para conectar tubos fluidos desechables a dos jeringas de vidrio de precisión de volumen de 250 microlitros.
Y pre-llenar una jeringa de vidrio de precisión con 250 microlitros de aceite portador que contiene 5%surfactante de harina, y una jeringa de vidrio de precisión con 50 microlitros de aceite portador. Cuando se hayan cargado ambas jeringas, cargue 100 microlitros de la mezcla de PCR en la jeringa de aceite portador y coloque un dispositivo microfluídico de gotas en el escenario de un microscopio de luz vertical equipado con una cámara de alta velocidad. Para la observación y registro de la formación de gotas en tiempo real, coloque las jeringas precargadas en una bomba de jeringa programable y utilice la unión máxima con accesorios para conectar el tubo de las jeringas al tubo de los canales de entrada respectivos del dispositivo microfluídico de gotas.
Coloque el tubo desde la salida del generador de gotas hasta el interior de un tubo PCR de 0,5 mililitros, y ajuste el caudal de la bomba de la jeringa a dos microlitros por minuto, para permitir que el tamaño de la gota se estabilice antes de recoger la emulsión resultante. Recoger lentamente y cuidadosamente la emulsión de la parte superior del tubo, y transferir 75 microlitros de la solución a un tubo PCR de 200 microlitros para el ciclo térmico. A continuación, confirme que el contenido de aceite en el tubo pcR coincide estrechamente con el volumen de la fase dispersa, para evitar la carbonescencia de las gotas durante el ciclo térmico, y coloque el tubo de 200 microlitro en el ciclor térmico.
Para la imagen por fluorescencia de la muestra emulsionada, transfiera la emulsión PCR a un tubo capilar de borosilicato profundo de 50 micrómetros con un perfil rectangular, para permitir la disposición de las gotas en una monocapa de 50 micras para la toma de imágenes. Después de fijar y sellar los capilares en un portaobjetos del microscopio, cargue el portaobjetos en la etapa del microscopio invertido. Y en el software de imágenes del microscopio, seleccione adquirir y vivir rápido, para iniciar la adquisición de la cámara en tiempo real.
A continuación, observe la muestra bajo campo brillante y microscopía de fluorescencia. Después de la generación de gotas y el ciclo térmico, las gotas se pueden introducir en un capilar de vidrio con un ancho de un milímetro y una altura de 50 micrómetros. Para obtener una distribución monocapa de las gotas que es ideal para la adquisición de imágenes de fluorescencia, se pueden grabar imágenes para cada longitud de onda.
Después del análisis de la imagen, la intensidad de fluorescencia de todas las gotas en sus respectivos fluoróforos se puede trazar para establecer el umbral de las gotas positivas y negativas. Después de la identificación y el recuento, se pueden calcular las copias por valores de gota, y el porcentaje de células CD3+T, y las células T reguladoras CD4+25+ se pueden determinar en función de las copias metiladas CD3Z y FOXP3 respectivamente, con respecto a las copias por gota del gen total de células o sin C. Los valores porcentuales se pueden comparar con los obtenidos a través de imágenes de inmunofluorescencia utilizando los anticuerpos adecuados.
Creo que la estabilidad de la emulsión desde la generación de gotas a través del ciclo térmico y los pasos finales de imagen de gotas es crucial para obtener resultados de cuantificación precisos, fiables y reproducibles. La personalización de MD PCR a través de la formulación de mezcla de PCR personalizada se puede utilizar para una serie de aplicaciones, incluyendo la investigación del cáncer, el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el análisis a nivel de una sola célula.
