كما نعلم بالفعل، فإن البيئة الدقيقة للورم هي جزء أساسي من نمو السرطان والغزو. لتقليد تطور السرطان، نحن بحاجة إلى مصفوفة ورم بشري ذات صلة بيولوجياً. هذه هي مصفوفة الورم البشري الوحيد القائم في المختبر في غزو المختبر.
بالمقارنة مع المقايسة كروية الكلاسيكية، وهذا الأسلوب ليست درجة الحرارة الحساسة ولا تتطلب نقل كروي. هذه التقنية مناسبة لعينات السرطان الصلبة المستمدة من المريض مثل سرطان الرأس والرقبة ويمكن أن تمتد نحو الطب الشخصي بما في ذلك علاجات التشيمورادييشن. وقد استخدمت هذه المصفوفة البشرية القائمة على الورم بالفعل لعدة تطبيقات بما في ذلك اختبار المخدرات عالية الإنتاجية، وتحليل الخلايا الحية، والتئام الجروح، والفحوصات نقل.
الخطوة الأكثر حساسية من الناحية الفنية هو طريقة التعامل مع الفيبرينوجين يضاف لذلك قد ترغب أولا في ممارسة هذه الخطوة مع آبار فارغة. من المهم أن تظهر التعامل السليم من المصفوفة وأنه من السهل لتحليل من خلال عرض الأسلوب بصريا. لتوليد الورم متعدد الخلايا، الاستغناء مرة واحدة 10 مرات إلى الخلايا الثالثة من خط الخلية من الاهتمام في 50 ميكرولترات من المتوسط الكامل في كل بئر من 96 جيدا مرفق منخفضة جدا جولة أسفل لوحة.
ثم ضع اللوحة في حاضنة ثقافة ثاني أكسيد الكربون 5٪ و 5٪ خلية قبل تأكيد تكوين الورم بصريا مع مجهر مقلوب. لإعداد مقايسة غزو كروي ثلاثي الأبعاد ، ذاب مصفوفة مشتقة من المايوما البشرية على الجليد وذوبان محلول مخزون الفيبرينوجين في حمام مائي 37 درجة مئوية. عندما ارتفعت درجة حرارة الكواشف ، امزج معاً الأحجام المناسبة من المصفوفة الكاملة المتوسطة المشتقة من myoma البشرية ، الخثرة ، البروتينين ، والفيبرينوجين ، مع إضافة الفيبرينوجين قبل صرف خليط المصفوفة في الخلايا.
إضافة على الفور 50 ميكرولترات من هلام الناتجة في كل بئر من لوحة ثقافة spheroid، وتوجيه تلميح نحو الجدار الداخلي لكل بئر وتباطؤ الأنابيب دون تحريك الرفو من وسط البئر. منذ الفيبرينوجين يبدأ هلام بعد بضع دقائق، فإنه يتطلب الأنابيب العكسي قوية ولكن دقيقة وعلاج سوى عدد قليل من الآبار في وقت واحد. العودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 30 دقيقة للسماح للجيل الريمي المصفوفة المشتقة من الإنسان لترسيخ قبل إضافة بلطف 100 ميكرولترات من المتوسط الكامل إلى أعلى كل هلام.
ثم صورة غزو spheroid يوميا. لتجزئة الصور باستخدام ilastik، افتح برنامج تصنيف الصور وتجزئة المصدر المفتوح وحدد سير عمل تصنيف بكسل. حفظ مشروع ilastik إلى الكمبيوتر.
سيتم تصنيف وحدات البكسل استنادًا إلى التعليقات التوضيحية التي قام بها المستخدم. انقر فوق إدخال البيانات وإضافة جديد لتحديد الصور للتحليل. لتحديد المعالم، انقر فوق تحديد المعالم وتحديد الميزات.
انقر فوق المربعات المناسبة لتحديد ميزات الاهتمام. سوف تتحول المربعات المحددة إلى اللون الأخضر. للحصول على تدريب، انقر على التدريب.
في قسم التدريب، يجب أن يكون هناك تسميات اثنين، التسمية 1 و 2 التسمية. وضع علامة على الخلفية باستخدام أحد التسميات ووضع علامة على الخلايا باستخدام التسمية الأخرى. عند تسمية كافة الخلايا والخلفية الموجودة في الصورة الأولى، حدد الصورة التالية من طريقة العرض الحالية لمتابعة وضع علامة على الخلايا والخلفية حتى يتم وضع علامة على 10٪ من الصور.
ثم حدد التحديث المباشر لتحليل جميع الصور. عند اكتمال التدريب وتحليل ilastik جميع الصور، انقر فوق تصدير التنبؤ وحدد التجزئة البسيطة من المصدر. ثم حدد تنسيق ملف الإخراج المطلوب من اختيار إعدادات صورة التصدير وانقر فوق تصدير الكل لتصدير نتائج التسمية.
سيتم تصدير الملفات إلى نفس المجلد مع الصور الأصلية. لتحليل المنطقة، أولاً فتح الصورة الأصلية مع شريط مقياس في Fiji Fiji، مع الحرص على أن الصورة لها نفس الحجم والبعد كما الصور المحللة. استخدم أداة تحديد الخط لرسم خط بطول معروف وانقر فوق تحليل وتعيين مقياس.
ثم قم بتعيين المسافة المعروفة في حقل المسافة المعروفة. تعيين الوحدة المناسبة ثم انقر فوق العمومية. لتثبيت البرنامج المساعد ilastik، انقر فوق "تعليمات" و"تحديث" ثم انقر فوق إدارة مواقع التحديث في إطار أداة تحديث ImageJ.
انقر بجوار ilastik، وإغلاق، وتطبيق التغييرات. بعد عدة دقائق، ستظهر نافذة معلومات تقول تحديثها بنجاح. انقر فوق موافق وأعد تشغيل ImageJ.
بعد ذلك، انقر فوق الإضافات ووحدات الماكرو وتثبيت وحدد العداد. ijm الملف. ثم انقر فوق فتح.
لإكمال تحليل المنطقة، انقر فوق الإضافات ثم قم بالتمرير لتحديد ilastik. حدد استيراد HDF5 وحدد الملف الذي له تنسيق h5. انقر فوق فتح وتحميل وتطبيق جدول البحث.
ثم انقر فوق الزر A على لوحة المفاتيح وستظهر المنطقة في نافذة الملخص كمساحة إجمالي. في هذه التجربة التمثيلية، بعد أربعة أيام من زرع الحنجرة الحرشفية خلية خلية سرطان بذر الخلية، مصفوفة أضيف على الزفيرويدات شكلت كما هو موضح، وكان يتم رصد الغزو يوميا على المجهر المقلوب. مرة واحدة جزءا لا يتجزأ، بدأت الخلايا في مصفوفة الفيبرين المشتقة من المايوما البشرية لغزو بسرعة بعد يوم واحد وامتدت إلى المصفوفة على مدى اليومين المقبلين.
لم الخلايا في المصفوفة الماوس الساركوما المستمدة لا تغزو في المصفوفة المحيطة، بدلا من ذلك تشكيل بنية غير متناظرة. الخلايا في الكولاجين غزت قليلا ولكن بسبب انكماش مصفوفة أصبح من الصعب تحليل. في بعض الآبار، اختفت الـ(ئيرويدات) بعد ثلاثة أيام.
هنا، يتم عرض القياس الكمي لغزو خلية سرطانية الحنجرة الأولية والنقلية الحرشفية في مصفوفة الفيبرين المشتقة من الورم العصبي البشري. تحليل الخلايا الحية من الإنسان mybrin المشتقة الفيبرين مصفوفة غزو spheroid يكشف عن حركة الخلية في فروع في جميع أنحاء المصفوفة التي تتبعها خلايا أخرى مع مرور الوقت. تذكر أن تكون حذراً على عدم نقل spheroid من مركز عند إضافة المصفوفة إلى الآبار.
ويمكن استخدام هذا الإجراء لدراسة كيفية التشعيع وجزيئات محددة مثل أدوية السرطان تؤثر على الغزو. يمكن أن تكون الخلايا ثابتة وملطخة للدراسات اللاحقة. في نموذج ساركوما الماوس الكلاسيكي ، تتكاثر الخلايا بشكل رئيسي وجانب الغزو هو الحد الأدنى.
هذه المصفوفة البشرية القائمة على الورم تحفز الغزو ، مما يجعل دراسات تثبيط أكثر كفاءة.
