Nuestro grupo de investigación se centra principalmente en la diafonía entre el cáncer y las células inmunitarias. Nuestro objetivo es investigar el impacto de diversos mecanismos biológicos en la evolución del cáncer de cabeza y cuello a través de la modulación de la inmunidad tumoral. El propósito de este protocolo es evaluar la invasión dentro de la matriz extracelular y la colocalización espacial de diferentes tipos de células en un contexto de múltiples capas.
La ventaja de este protocolo es el uso de heterosferoides que incorporan dos tipos de células no neoplásicas relevantes junto con las células cancerosas para analizar la invasión con matriz extracelular hacia una membrana microporosa y estímulos de quimiotaxis. Para empezar, agregue nanopartículas magnéticas a la suspensión celular y mezcle 10 veces. Centrifugar las células a 400 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y mezclar 10 veces para volver a suspender las células.
A continuación, transfiera y mezcle todas las células en un nuevo tubo para el cocultivo, y dispense 100 microlitros de células cocultivadas en cada pocillo de una placa de fijación ultrabaja. Inserte el campo magnético de accionamiento de esferoide debajo de la placa para inducir la agregación y la formación de esferoides, y colóquelo en la incubadora durante tres horas. Con una punta de 200 microlitros, agregue 50 microlitros de ECM al centro de una membrana microporosa de 24 pocillos.
Retire las burbujas con una aguja estéril, asegurándose de que la matriz cubra uniformemente la superficie de la membrana. Incubar la membrana durante una hora a 37 grados centígrados para la formación de gel. Para empezar, prepare el cultivo celular 3D y la membrana microporosa recubierta de matriz extracelular.
Añadir 500 microlitros de medio de cultivo, suplementado con un 10% de suero fetal bovino en la cámara inferior de la membrana microporosa como quimioatrayente. A continuación, retire con cuidado el medio de los heteroesferoides formados y añada suavemente 50 microlitros de medio fresco no suplementado por pocillo sobre el esferoide. Con unas tijeras estériles, corte el borde de una punta de baja retención de 200 microlitros y recoja el esferoide, junto con 50 microlitros de medio.
Coloque suavemente el esferoide sobre la matriz extracelular. A continuación, agregue con cuidado 150 microlitros de medio no suplementado gota a gota para alcanzar un volumen total de 200 microlitros. Coloque la placa en la incubadora durante 48 horas.
Haga clic en archivo en el software de análisis. Seleccione abrir, luego elija la imagen y haga clic en aceptar. A continuación, haga clic en analizar, seguido de establecer medidas para seleccionar el área, la densidad integrada y la etiqueta de visualización.
Haga clic en Aceptar. Finalmente, haga clic en analizar y luego medir. Las imágenes de campo claro representan la localización de esferoides o células, identificadas por conglomerados oscuros o negros.
Las imágenes de las diferentes células mostraron variación en la intensidad y cantidad de fluorescencia a través de diferentes imágenes a lo largo del eje Z, lo que indica diferentes patrones de proliferación e invasión entre las células. Utilizando microscopía confocal, se superpusieron diferentes canales para visualizar los patrones de colocalización durante la invasión. El análisis de imágenes de los resultados representativos presentados indicó que los monocitos invaden primero, seguidos de las células neoplásicas, y los fibroblastos son las últimas células en invadir la matriz extracelular.
