우리가 이미 알다시피, 종양 미세 환경은 암 성장과 침략의 필수적인 부분입니다. 암종 진행을 모방하기 위해 생물학적으로 관련된 인간 종양 매트릭스가 필요합니다. 이것은 체외 침입 분석체에 근거를 둔 유일한 인간 종양 매트릭스입니다.
고전 스페로이드 분석법에 비해,이 방법은 온도에 민감한되지 않으며 스페로이드 전송이 필요하지 않습니다. 이 기술은 두경부 암과 같은 환자 유래 고형암 샘플에 적합하며 화학 요법을 포함한 개인화 된 약으로 확장 될 수 있습니다. 이 인간 종양 계열 매트릭스는 이미 고처리량 약물 검사, 라이브 세포 분석, 상처 치유 및 전달 분석 등을 포함한 여러 응용 분야에 사용되어 왔다.
가장 기술적으로 민감한 단계는 피브리노겐의 방법의 처리가 추가되므로 먼저 빈 우물로이 단계를 연습할 수 있습니다. 매트릭스의 적절한 처리를 표시하는 것이 중요하며 방법을 시각적으로 보여 줌으로써 분석하기 쉽습니다. 다세포 종양 스페로이드 생성의 경우, 96웰 초저 부착 라운드 하단 플레이트의 각 웰에 완전한 배지의 50 마이크로리터에 관심 있는 세포주에서 제3 세포로부터 10번 을 분배한다.
그런 다음 플레이트를 섭씨 37도 및 이산화탄소 세포 배양 인큐베이터에 넣고 4일 동안 정시적으로 반전된 현미경으로 종양 스페로이드 형성을 확인합니다. 3차원 스페로이드 침입 분석법을 설정하려면 인간의 무종 유래 매트릭스를 얼음에 해동하고 피브리노겐 스톡 용액을 섭씨 37도의 수조에 해동하십시오. 시약이 따뜻해지면, 완전한 배지, 인간 근종 유래 매트릭스, 트롬빈, 아프로틴 및 피브리노겐의 적절한 양을 혼합하고, 세포에 매트릭스 혼합물을 분배하기 직전에 피브리노겐을 첨가한다.
즉시 생성 된 젤의 50 마이크로 리터를 스페로이드 배양 플레이트의 각 우물에 추가하여 각 우물의 내부 벽을 향해 팁을 지시하고 우물의 중심에서 스페로이드를 움직이지 않고 감속합니다. 피브리노겐은 몇 분 후에 젤을 시작하기 때문에 견고하지만 정확한 역 파이프팅과 한 번에 몇 개의 우물만 처리해야합니다. 각 겔의 상단에 완전한 배지 100 마이크로리터를 부드럽게 추가하기 전에 인간 근종 유래 매트릭스 피브린 젤이 고화되도록 30 분 동안 세포 배양 배양 인큐베이터에 플레이트를 반환합니다.
그런 다음 매일 스페로이드 침공을 이미지합니다. ilastik로 이미지 세분화의 경우 오픈 소스 이미지 분류 및 세분화 소프트웨어를 열고 픽셀 분류 워크플로를 선택합니다. ilast식 프로젝트를 컴퓨터에 저장합니다.
픽셀은 사용자가 주석을 기반으로 분류됩니다. 입력 데이터를 클릭하고 새로 추가하여 분석을 위한 이미지를 선택합니다. 기능 선택을 위해 기능 선택을 클릭하고 피처를 선택합니다.
관심 있는 기능을 선택하려면 적절한 상자를 클릭합니다. 선택한 상자가 녹색으로 바뀝니다. 교육을 보려면 교육을 클릭합니다.
교육 섹션에는 레이블 1과 레이블 2라는 두 개의 레이블이 있어야 합니다. 레이블 중 하나로 배경을 표시하고 다른 레이블로 셀을 표시합니다. 첫 번째 이미지 내의 모든 셀과 배경에 레이블이 지정된 경우 현재 보기에서 다음 이미지를 선택하여 이미지의 10%가 표시될 때까지 셀과 배경을 계속 표시합니다.
그런 다음 라이브 업데이트를 선택하여 모든 이미지를 분석합니다. 교육이 완료되고 ilastik이 모든 이미지를 분석한 경우 예측 내보내기를 클릭하고 소스에서 간단한 세분화를 선택합니다. 그런 다음 이미지 설정 내보내기에서 원하는 출력 파일 형식을 선택하고 모두 내보내기를 클릭하여 레이블 결과를 내보냅니다.
파일은 원본 이미지와 동일한 폴더로 내보내집니다. 영역 분석을 위해 먼저 피지 ImageJ의 스케일 막대로 원본 이미지를 열어 분석된 이미지와 동일한 크기와 치수를 가지고 있음을 주의하십시오. 선 선택 도구를 사용하여 알려진 길이의 선을 그리고 분석 및 설정 배율의 선을 클릭합니다.
그런 다음 알려진 거리 필드에서 알려진 거리를 설정합니다. 적절한 단위를 설정하고 전역을 클릭합니다. ilastik 플러그인을 설치하려면 도움말 및 업데이트를 클릭하고 ImageJ 업데이트 창에서 업데이트 사이트 관리를 클릭합니다.
ilastik 옆을 클릭, 닫기, 변경 사항을 적용합니다. 몇 분 후에 정보 창이 성공적으로 업데이트된 것으로 표시됩니다. 확인을 클릭하고 ImageJ를 다시 시작합니다.
다음으로 플러그인, 매크로를 클릭하고 카운터를 선택합니다. ijm 파일. 그런 다음 열기를 클릭합니다.
지역 분석을 완료하려면 플러그인을 클릭하고 스크롤하여 ilastik을 선택합니다. HDF5 가져오기를 선택하고 h5 형식으로 파일을 선택합니다. 열기 및 로드를 클릭하고 조회 테이블을 적용합니다.
그런 다음 키보드의 A 버튼을 클릭하면 영역이 요약 창에 전체 영역으로 표시됩니다. 본 대표적인 실험에서, 전이성 후두 편평세포세포주 종자 후 4일 후, 매트릭스를 형성된 스페로이드에 첨가하고 반전된 현미경으로 매일 모니터링하였다. 일단 내장되면, 인간 근종 유래 피브린 매트릭스에 있는 세포는 1 일 후에 급속하게 침략하기 시작하고 다음 이틀 동안 매트릭스로 확장하기 시작했습니다.
마우스 육종 유래 매트릭스내의 세포는 주변 행렬로 침입하지 않고 비대칭 구조를 형성하였다. 콜라겐내의 세포는 약간 침략했지만 매트릭스 수축으로 인해 분석이 어려워졌습니다. 일부 우물에서는 3일 후에도 스페로이드가 사라졌습니다.
여기서, 인간 근종 유래 피브린 매트릭스에서 1차 및 전이성 후두 편평세포 암종의 침전을 정량화하는 것이 나타난다. 인간 근종 유래 피브린 매트릭스 스페로이드 침략의 살아있는 세포 분석은 시간이 지남에 따라 다른 세포에 선행되는 매트릭스 전체에 걸쳐 가닥에서 세포 움직임을 드러낸다. 매트릭스를 우물에 추가할 때 스페로이드를 중앙 위치에서 이동하지 않도록 주의해야 합니다.
이 절차는 암 약과 같은 특정 분자가 침략에 어떻게 영향을 미치는지 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 세포는 후속 연구를 위해 고정되고 얼룩질 수 있습니다. 고전적인 마우스 육종 모델에서, 세포는 주로 증식하고 침략 측면은 최소화된다.
이 인간 종양 계의 매트릭스는 침략을 유도하여 억제 연구를 보다 효율적으로 만듭니다.
