Bildiğimiz gibi, tümör mikroçevre kanser büyüme ve invazyon önemli bir parçasıdır. Karsinom ilerlemesini taklit etmek için biyolojik olarak ilgili bir insan tümör matrisine ihtiyacımız var. Bu in vitro invazyon testindeki tek insan tümör matrisi.
Klasik küresel tsay ile karşılaştırıldığında, bu yöntem ısıya duyarlı değildir ve küresel transfer gerektirmez. Bu teknik, baş ve boyun karsinomu gibi hasta kaynaklı katı kanser örnekleri için uygundur ve kemoradyasyon tedavileri de dahil olmak üzere kişiselleştirilmiş tıp doğru uzatılabilir. Bu insan tümör tabanlı matris zaten yüksek iş itimi ilaç testi, canlı hücre analizi, yara iyileşmesi ve transfer testleri de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılmıştır.
Teknik olarak en hassas adım, yöntemin fibrinojen işekilde işlenmesine eklenmedir, böylece önce bu adımı boş kuyularla uygulamak isteyebilirsiniz. Matrisin doğru şekilde işlenmesini göstermek önemlidir ve yöntemi görsel olarak göstererek analiz etmek kolaydır. Çok hücreli tümör küresel nesil için, 96-iyi ultra-düşük eki yuvarlak alt plaka her kuyuiçine tam orta 50 mikrolitre ilgi hücre hattından üçüncü hücrelere bir kez 10 dağıtmak.
Daha sonra, ters mikroskopla tümör küresel oluşumunu görsel olarak doğrulamadan önce plakayı dört gün boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Üç boyutlu bir küresel istila tonu kurmak için, buz üzerinde insan miyom kaynaklı matris eritin ve 37 santigrat derece su banyosunda fibrinojen stok çözeltisi çözültün. Reaktifler ısındığında, tam orta, insan miyom kaynaklı matris, trombin, aprotinin ve fibrinojen in uygun hacimlerde birlikte karıştırın, sadece hücrelere matris karışımı dağıtmadan önce fibrinojen ekleyerek.
Hemen küresel kültür plakaher kuyuiçine ortaya çıkan jel 50 mikrolitre ekleyin, her kuyunun iç duvarına doğru ucu yönlendiren ve kuyunun merkezinden spheroid hareket etmeden yavaşlama borulama. Fibrinojen birkaç dakika sonra jel başlar bu yana, sağlam ama hassas ters pipetleme ve bir seferde sadece birkaç kuyunun tedavisi gerektirir. İnsan miyom kaynaklı matriks fibrin jelinin her jelin üstüne 100 mikrolitre tam orta eklemeden önce katılaşmasını sağlamak için plakayı 30 dakika boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri verin.
Sonra her gün küresel istilayı görüntüle. ilastik ile görüntü bölümleme için açık kaynak görüntü sınıflandırmave segmentasyon yazılımını açın ve Piksel Sınıflandırmaiş akışını seçin. ilastik projeyi bilgisayara kaydedin.
Pikseller, kullanıcı tarafından yapılan ek açıklamalara göre sınıflandırılır. Analiz için görüntüleri seçmek için Giriş Verileri ve Yeni Ekle'yi tıklatın. Özellik seçimi için Özellik Seçimi ve Özellikleri Seç'i tıklatın.
İlgi çekici özellikleri seçmek için uygun kutuları tıklatın. Seçili kutular yeşile döner. Eğitim için Eğitim'i tıklatın.
Eğitim bölümünde, Etiket 1 ve Etiket 2 olmak üzere iki etiket olmalıdır. Arka planı etiketlerden biriyle işaretleyin ve hücreleri diğer etiketle işaretleyin. İlk görüntüdeki tüm hücreler ve arka plan etiketlendiğinde, görüntülerin %10'u işaretlenene kadar hücreleri ve arka planı işaretlemeye devam etmek için geçerli görünümden sonraki görüntüyü seçin.
Ardından tüm görüntüleri analiz etmek için Canlı Güncelleştirme'yi seçin. Eğitim tamamlandığında ve ilastik tüm görüntüleri analiz ettiğinde, Tahmin Verme'yi tıklatın ve Kaynaktan Basit Segmentasyon'u seçin. Ardından Dışa Aktarma Görüntü Ayarlarını Seçin'den istenen çıktı dosya biçimini seçin ve etiketleme sonuçlarını dışa aktarmak için Tümünü Dışa Aktar'ı tıklatın.
Dosyalar orijinal görüntülerle aynı klasöre dışa aktarılır. Alan analizi için, ilk olarak orijinal görüntüyü Fiji ImageJ'de bir ölçek çubuğuyla açın ve görüntünün analiz edilen görüntülerle aynı boyut ve boyuta sahip olmasına dikkat edin. Bilinen uzunlukta bir çizgi çizmek için çizgi seçim aracını kullanın ve Çözümle ve Ölçek'i ayarla'yı tıklatın.
Daha sonra bilinen mesafe alanında bilinen mesafeyi ayarlayın. Uygun birimi ayarlayın ve Global'i tıklatın. ilastik eklentisini yüklemek için Yardım ve Güncelleştir'i tıklatın ve ImageJ güncelleyici penceresinde güncelleştirme sitelerini yönet'i tıklatın.
ilastik, Kapat ve Uygula değişikliklerinin yanına tıklayın. Birkaç dakika sonra, başarıyla güncelleştirilen bir bilgi penceresi görüntülenir. Tamam'ı tıklatın ve ImageJ'i yeniden başlatın.
Ardından, Eklentiler, Makrolar'ı tıklatın ve Yükleyin ve sayacı seçin. ijm dosyası. Ardından Aç'ı tıklatın.
Alan analizini tamamlamak için Eklentiler'i tıklatın ve ilastik'i seçmek için kaydırın. HDF5'i Aktar'ı seçin ve h5 formatındaki dosyayı seçin. Aç ve Yükle'yi tıklatın ve arama tablosunu uygulayın.
Ardından klavyedeki A düğmesini tıklatın ve alan toplam alan olarak özet penceresinde görünür. Bu temsili deneyde, metastatik laringeal skuamöz hücreli karsinom hücre liline fidesi den dört gün sonra, matriks, gösterildiği gibi oluşan küresel lere eklenmiş ve inverted mikroskopta her gün istila izlenmiştir. Bir kez gömülü, insan miyom kaynaklı fibrin matris hücreleri hızla bir gün sonra işgal etmeye başladı ve sonraki iki gün içinde matris içine uzatıldı.
Fare sarkomu türemiş matristeki hücreler çevredeki matrisin içine giremedi, bunun yerine asimetrik bir yapı oluşturdular. Kollajenhücreleri biraz işgal ama matris büzülme nedeniyle analiz zor oldu. Bazı kuyularda, küreseller üç gün sonra bile ortadan kayboldular.
Burada insan miyomu kaynaklı fibrin matrisinde primer ve metastatik laringeal skuamöz hücreli karsinom hücresinin invazyonunun nicelliği gösterilmiştir. İnsan miyomu kaynaklı fibrin matriks küresel invazyonunun canlı hücre analizi, zaman içinde diğer hücreler tarafından takip edilen matris boyunca iplikçiklerde hücre hareketini ortaya çıkarır. Matrisi kuyulara eklerken küresel liği merkez konumdan oynatmamaya dikkat edin.
Bu prosedür, ışınlama ve kanser ilaçları gibi belirli moleküllerin invazyonu nasıl etkilediğini incelemek için kullanılabilir. Hücreler sonraki çalışmalar için sabit ve lekeli olabilir. Klasik fare sarkomu modelinde hücreler esas olarak çoğalır ve istila yönü çok azdır.
Bu insan tümör tabanlı matris invazyona neden olur, inhibisyon çalışmalarını daha verimli hale getirir.
