Los métodos presentados aquí permiten la cuantificación de las lesiones del ADN inducidas por el estrés oxidativo, contribuyendo a la comprensión de los mecanismos fisiopatológicos que pueden ser objetivo para la prevención y el tratamiento de enfermedades. La selectividad y la sensibilidad son las principales ventajas. La selectividad es una ventaja esencial cuando se trabaja con muestras biológicas complejas.
HPLC acoplado a espectrometría de masas en tándem evolucionó como el estándar de oro para este tipo de cuantificación con matrices biológicas. El estrés oxidativo es un evento común a diferentes procesos fisiopatológicos. Aumento de los niveles de aductos etheno se han detectado en los tejidos u orina de pacientes con enfermedades inflamatorias.
Las lesiones de ADN también proporcionan información sobre eventos endógenos desencadenados por la exposición a contaminantes. Si las lesiones de ADN aumentan, la exposición puede estar en el nivel que aumenta el riesgo de desarrollo del cáncer, por ejemplo. Las lesiones se pueden cuantificar en el ADN de cualquier sistema celular y alternativamente en orina, plasma, medio de cultivo de saliva con adaptaciones en la preparación de la muestra.
Para comenzar, usa una placa de cultivo colocada sobre hielo como base para cortar un pedazo de tejido con un bisturí. Pesar un gramo del tejido en cada tubo tapado de 50 mililitros para su uso inmediato. Mantenga el tejido restante sobre hielo seco antes de almacenarlo a menos 80 grados centígrados.
A cada tubo, agregue 10 mililitros de la solución de lelisis de células comerciales que contengan deferoxamina de 0,5 milivolares y manténgalo en hielo. Ajuste el homogeneizador de tejido a una velocidad baja, alrededor de 60 a 90 rpm. Homogeneizar los tejidos sobre hielo durante unos minutos hasta que la solución esté sin fragmentos de tejido.
A continuación, añadir 150 microlitros de solución de proteinasa K a cada muestra homogeneizada. Agitar los tubos por inversión, y mantenerlos a temperatura ambiente durante la noche. Por la mañana, añadir 40 microlitros de ribonucleasa Una solución, agitar por inversión y mantener los tubos a temperatura ambiente durante dos horas.
Añadir cinco mililitros de solución comercial de precipitación proteica, vórtice vigorosamente, y centrifugar a 2.000 veces g, cuatro grados centígrados, durante 10 minutos. Transfiera los sobrenadantes a tubos tapados de 50 mililitros que contengan 10 mililitros de isopropanol frío. Invierta los tubos suavemente varias veces hasta la observación del ADN precipitado.
Utilice una pipeta Pasteur cerrada al final para recoger el ADN precipitado. Transfiera el ADN recogido a tubos que contengan cuatro mililitros de tampón Tris de 10 mililitrolares y deferoxamina de un milimolar a pH siete para disolverse. Después de que el ADN se disuelva por completo en los tubos, añada cuatro mililitros de una solución de cloroformo que contenga 4%alcohol isoamilo a cada tubo.
Invertir los tubos 10 veces para la homogeneización, centrifugar a 2.000 veces g, cuatro grados Celsius, durante 10 minutos, y transferir las fases superiores a nuevos tubos. Repita el lavado de la fase superior con la solución de cloroformo dos veces más. A continuación, agregue ocho mililitros de etanol absoluto y 0,4 mililitros de una solución de cloruro sódico de cinco molares para precipitar el ADN.
Una vez más, recoger el ADN precipitado, y transferirlo a tres mililitros de 70%etanol. Repita el lavado con 70% de etanol una vez más. Deseche la solución de etanol con precaución e invierta los tubos que contienen el ADN precipitado en papel absorbente para eliminar el exceso de solución.
Después de preparar muestras de hidrólisis de ADN con estándar isotópico 15N5 de 1, N6-etheno-deoxyadenosina y 15N5 estándar isotópico de 1, N2-etheno-deoxyguanosina según el manuscrito, transferir 10 microlitros de cada muestra en tubos para la cuantificación de desoxnucleósidos normales por HPLC-UV. Somete el volumen residual a la extracción en fase sólida. Para realizar HPLC, primero ele una columna C18 unida a un cartucho C18 SecurityGuard con un gradiente de 0.1% de ácido fórmico y metanol.
Configure el programa de gradiente para que se ejecute de cero a 25 minutos con cero a 18%metanol, de 25 a 27 minutos con 18 a 0%metanol, luego de 27 a 37 minutos con 0%metanol a un caudal de un mililitro por minuto y 30 grados Celsius. Después de eso, inyecte un volumen entre dos y seis microlitros para cada muestra reservada para la cuantificación normal de desoxigenósidos. Ajuste el detector DAD en 260 nanómetros para la integración de los picos de desoxiguanosina y desoxianosina.
Para realizar la extracción en fase sólida para análisis de 1, N6-etheno-deoxyadenosine y 1, N2-etheno-deoxyguanosine, primero cargue los cartuchos con una serie de soluciones a un volumen de un mililitro. Añadir 100%metanol, agua desionizada, muestra de ADN hidrolizado, agua desionizada, 10%metanol, 15%metanol, y por último 100%metanol para la recolección. A continuación, proceda de acuerdo con el manuscrito.
Después de preparar muestras de hidrólisis de ADN 15N5 isotopic estándar de 8-oxo-deoxyguanosina, transferir 80 microlitros de cada muestra a viales para su análisis en el sistema HPLC-ESI-MS/MS. Reservar los 20 microlitros restantes para la cuantificación de la desoxiguanosina en HPLC-UV, como se hizo anteriormente. Para el análisis de 8-oxo-desoxiguanosina en HPLC-ESI-MS/MS, eluía la columna C18 A acoplada a un cartucho C18 SecurityGuard con un gradiente de disolvente A y B a un caudal de 150 microlitros por minuto y 25 grados Celsius.
Ejecute la bomba binaria con un cero a 15% del disolvente B durante los primeros 25 minutos, entre el 15 y el 80% del disolvente B de 25 a 28 minutos, el 80% del disolvente B de 28 a 31 minutos, el 80 al 0% del disolvente B de 31 a 33 minutos y el 0% del disolvente B de 33 a 46 minutos. Dirija los primeros 16 minutos de la columna A eluyente a desperdiciar. Condicione la columna B por la bomba isocrática con una solución de 15%metanol en agua que contenga 0,1% de ácido fórmico a un caudal de 150 microlitros por minuto.
Después de seis minutos, revise el cromatograma para asegurarse de que el uno estándar 8-oxo-deoxyguanosina de la columna A.Durante el intervalo de 16 a 32 minutos, cambie la válvula a la posición que permita la conexión entre la columna A y la columna B.Cierre la válvula a los 32 minutos para elir 8-oxo-desoxiguanosina de la segunda columna y obtener un pico cromatográfico nítido. Para el análisis de 1, N6-etheno-deoxyadenosina y 1, N2-etheno-deoxyguanosina, ele una columna C18 acoplada a un cartucho C18 SecurityGuard con un gradiente de disolvente A y B a un caudal de 130 microlitros por minuto y 25 grados Celsius. Ejecute la bomba binaria con 0% del disolvente B durante los primeros 10 minutos, cero a 20% del disolvente B durante 10 a 39 minutos, 20 a 75% del disolvente B de 39 a 41 minutos, 75% del disolvente B de 41 a 46 minutos, 75 a 0% del disolvente B de 46 a 47 minutos, y 0% del disolvente B de 47 a 60 minutos.
Utilice la válvula de conmutación para dirigir los primeros 35 minutos de eluyente a residuos y la fracción de 35 a 42 minutos a la fuente ESI. Asegúrese de que las normas de aducto se eluden de la columna en el intervalo establecido. Integrar los picos de 8-oxo-deoxyguanosina 15N5 estándar isotópico de 8-oxo-desoxiguanosina, 1, N6-etheno-deoxyadenosina, 15N5 isotopic estándar de 1, N6-etheno-deoxyadenosine, 1, N2-etheno-deoxyguanosine, y 15N5 isotopic estándar de 1, N2-etheno-deoxyguanosine de los análisis HPLC-ESI-MS/MS.
Calcule las relaciones de área para las curvas de calibración y las muestras. Establezca las curvas de calibración y calcule las cantidades de lesiones en cada muestra inyectada. Integrar los picos de desoxiguanosina y desoxianosina a partir de los análisis HPLC-UV.
Utilice las áreas para establecer las curvas de calibración y calcular las cantidades de desoxiguanosina y desoxiaadenosina en animales en cada muestra inyectada. Calcular las fracciones molares para 8-oxo-deoxyguanosina sobre desoxiguanosina, 1, N6-etheno-deoxyadenosina sobre desoxiaadenosina, y 1, N2-etheno-deoxyguanosina sobre desoxiguanosina, que dan el número de lesiones por un millón de desoxianosina normal o desoxiaadenosina. Un cromatograma representativo del ADN purificado obtenido por HPLC-UV muestra la presencia de los cuatro desoxigenósidos normales, libres de los ribonucleósidos del ARN, demostrando la pureza del ADN.
Se muestran cromatogramas representativos de HPLC-ESI-MS/MS de 8-oxo-deoxyguanosina, 1, N6-etheno-deoxyadenosine, y 1, N2-etheno-deoxyguanosina en muestras de ADN de tejido en ratones. El cromatograma obtenido con detección UV muestra los cuatro desoxinucleósidos normales eluidos desde la primera columna hasta unos 10 minutos, con una buena separación de 8-oxo-desoxiguanosina, eliminando las interferencias no deseadas. Una cosa importante a recordar para las cuantificaciones exactas es tener siempre las mismas cantidades de estándares internos en el volumen de inyección en las curvas de calibración y muestras.
Los métodos presentados aquí pueden adaptarse para la cuantificación de otros desoxinucleósidos modificados. La ampliación de la banda de desoxnucleósidos modificados permite una mejor comprensión de los mecanismos fisiopatológicos subyacentes. Podemos investigar el papel del daño oxidativo en diferentes situaciones como la exposición a xenobióticos, diabetes y transformación maligna celular, ayudando así al desarrollo de estrategias preventivas y de tratamiento.
