Burada sunulan yöntemler, oksidatif stresin neden olduğu DNA lezyonlarının sayısallaştırılmasına olanak sağlayarak, hastalıkların önlenmesi ve tedavisi için hedef olabilecek patofizyolojik mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır. Seçicilik ve duyarlılık başlıca avantajlarıdır. Seçicilik karmaşık biyolojik numuneler ile çalışırken önemli bir avantajdır.
HPLC tandem kütle spektrometresi ile birleştiğinde biyolojik matrisler ile nicelleştirme bu tür altın standart olarak gelişti. Oksidatif stres farklı patofizyolojik süreçleriçin ortak bir olaydır. İnflamatuar hastalığı olan hastaların doku veya idrarında eto adducts düzeylerinin arttığı saptanmıştır.
DNA lezyonları da kirleticilere maruz kalma tarafından tetiklenen endojen olaylar hakkında bilgi sağlar. DNA lezyonları artarsa, maruz kalma kanser gelişimi riskini artıran düzeyde olabilir, örneğin. Lezyonlar herhangi bir hücresel sistemden DNA'da ve alternatif olarak idrar, plazma, tükürük kültürü ortamında örnek hazırlama da adaptasyonlarla ölçülebilir.
Başlamak için, neşter ile doku parçası kesmek için bir temel olarak buz üzerine yerleştirilen bir kültür plakası kullanın. Hemen kullanım için her 50 mililitrelik kapaklı tüp doku bir gram tartın. Eksi 80 santigrat derecede depolamadan önce kalan dokuyu kuru buzda saklayın.
Her tüp için, 0.5 milimolar deferoksamin içeren ticari hücre lisis çözeltisi 10 mililitre ekleyin ve buz üzerinde tutmak. Düşük bir hıza doku homogenizer ayarlayın, yaklaşık 60-90 rpm. Çözelti doku parçaları olmadan birkaç dakika buz üzerindeki dokuları homojenize.
Daha sonra, her homojenize örnek proteinaz K çözeltisi 150 mikrolitre ekleyin. Tüpleri ters çevirerek sallayın ve gece boyunca oda sıcaklığında tutun. Sabah, ribonuclease Bir çözelti 40 mikrolitre ekleyin, ters sallamak, ve iki saat boyunca oda sıcaklığında tüpler tutun.
Ticari protein yağış çözeltisi beş mililitre ekleyin, girdap şiddetle, ve santrifüj 2, 000 kez g, dört derece santigrat, 10 dakika. Supernatants 50 mililitre kapaklı tüpler soğuk izopropanol 10 mililitre içeren aktarın. Çökelmiş DNA gözlemi yapılana kadar tüpleri birkaç kez hafifçe ters çevirin.
Çökelmiş DNA toplamak için sonunda kapalı bir Pasteur pipet kullanın. Toplanan DNA'yı 10 milimolar Tris tamponunun dört mililitresini içeren tüplere ve pH 7'de bir milimolar deferoksamin içeren tüplere aktarın. DNA tüplerde tamamen çözüldükten sonra, her tüpe %4 isoamyl alkol içeren dört mililitre kloroform çözeltisi ekleyin.
Tüpleri homojenizasyon için 10 kez ters çevirin, 2, 000 kez g santrifüj, dört santigrat derece, 10 dakika, ve yeni tüpler için üst aşamaları aktarın. Kloroform çözeltisi ile üst fazın yıkanan iki kez daha tekrarlayın. Sonra, DNA çökelti için mutlak etanol sekiz mililitre ve beş molar sodyum klorür çözeltisi 0.4 mililitre ekleyin.
Yine, çökelmiş DNA toplamak ve% 70 etanol üç mililitre aktarın. Yıkamayı %70 etanol ile bir kez daha tekrarlayın. Etanol çözeltisini dikkatli bir şekilde atın ve aşırı çözeltiyi çıkarmak için çökelmiş DNA içeren tüpleri emici kağıda ters çevirin.
15N5 izotopik standardı 1, N6-etheno-deoksiadenozin ve 15N5 izotopik standardı 1, El yazmasına göre N2-etheno-deoksiguanozin ile DNA hidroliz örnekleri hazırlandıktan sonra, hplc-UV ile normal deoksinükleozitlerin ölçülmesi için her numunenin 10 mikrolitresini tüplere aktarın. Artık hacmi katı faz çıkarma konusuna tabi tart.rekti. HPLC'yi gerçekleştirmek için, %0,1 formik asit ve metanol degradesi olan C18 SecurityGuard kartuşu ile bağlı bir C18 sütununu ilk kez takın.
Degrade programını sıfırdan 25 dakikaya sıfırdan %18'e kadar metanolle, 25-27 dakikadan %18 ila %0 metanolle, sonra dakikada bir mililitre ve 30 santigrat derecelik bir akış hızıyla %0 metanolle 27 ila 37 dakikadan çalışacak şekilde ayarlayın. Bundan sonra, normal deoksinükleonitler nicelleştirme için ayrılmış her örnek için iki ve altı mikrolitre arasında bir hacim enjekte edin. Deoksiguanozin ve deoksiadenozin zirvelerinin entegrasyonu için 260 nanometre de BABA dedektörü ayarlayın.
1, N6-etheno-deoksiadenozin ve 1, N2-etheno-deoksiguanozin analizleri için katı faz ekstraksiyon gerçekleştirmek için, ilk bir mililitre hacimde bir dizi çözelti ile kartuşları yükleyin. Toplama için %100 metanol, deiyonize su, hidrolize DNA örneği, deiyonize su, %10 metanol, %15 metanol ve son olarak %100 metanol ekleyin. Sonra, el yazmasına göre devam edin.
DNA hidroliz örnekleri hazırlandıktan sonra 15N5 izotopik standart 8-okso-deoksiguanozin, HPLC-ESI-MS/MS sisteminde analiz için her numunenin 80 mikrolitresini şişelere aktarın. Daha önce yapıldığı gibi, HPLC-UV üzerinde deoksiguanozin in sayısallaştırılması için kalan 20 mikrolitreyi rezerve edin. HPLC-ESI-MS/MS üzerinde 8-oxo-deoksiguanozin analizi için, C18 sütun A dakikada 150 mikrolitre ve 25 santigrat derece bir akış hızında solvent A ve B bir degrade ile birleştiğinde C18 sütun birleştiğinde elute.
İlk 25 dakika boyunca B çözücünün sıfır ila %15'i, 25-28 dakika dan B çözücünün %15 ila %80'ini, 28-31 dakikadan solvent B'nin %80'ini, 31-33 dakikadan B solventinin %80'ini ve 33-46 dakikadan %0'ı çözücü B ile çalıştırın. A sütununun ilk 16 dakikasını boşa yönlendirin. Dakikada 150 mikrolitre akış hızında %0.1 formik asit içeren suda %15 metanol çözeltisi olan izokratik pompa ile B kolonu.
Altı dakika sonra, 16 ila 32 dakika aralığında sütun A.during 8-okso-deoksiguanozin standart elutes sağlamak için kromatogram kontrol, sütun A ve sütun B arasında bağlantı sağlayan pozisyona vana geçiş.İkinci sütundan 8-oxo-deoksiguanozin yakın ve keskin bir kromatografik tepe olsun 32 dakika valf kapatın. 1 analizi için, N6-etheno-deoksiadenozin ve 1, N2-etheno-deoksiguanozin, dakikada 130 mikrolitre ve 25 santigrat derece bir akış hızında çözücü A ve B degradesi ile bir C18 SecurityGuard kartuş bir c18 sütun birleştiğinde bir C18 sütun elute. İkili pompayı ilk 10 dakika için %0, B solventinin %20'sini 10 ila 39 dakika, B solventinin %20 ila %75'ini 39 dakikadan 41 dakikaya, %75'ini 41 dakikadan 46 dakikaya, B solventinin %75'ini 46-47 dakika ve %0'ı 47-60 dakika arasında çalıştırın.
İlk 35 dakikayı atıklara ve ESI kaynağına 35-42 dakikalık fraksiyonu yönlendirmek için anahtarlama valfini kullanın. Adduct standartlarının ayarlanan aralıktaki sütundan silindiğinden emin olun. 8-oxo-deoksiguanozin 15N5 izotopik standart 8-oxo-deoksiguanozin doruklarını entegre, 1, N6-etheno-deoksiadenozin, 15N5 izotopik standart 1, N6-etheno-deoksiadenozin, 1, N2-etheno-deoksiguanozin, ve 15N5 izotopik standart 1, HPLC-ESI-MS/MS analizlerinden N2-etheno-deoksiguanozin.
Kalibrasyon eğrileri ve numuneler için alan oranlarını hesaplayın. Kalibrasyon eğrilerini belirleyin ve enjekte edilen her örnekteki lezyonların miktarlarını hesaplayın. HPLC-UV analizlerinden deoksiguanozin ve deoksiadenozin zirvelerini entegre edin.
Kalibrasyon eğrileri kurmak için alanları kullanın ve her enjekte örnek hayvanlarda deoksiguanozin ve deoksiadenozin miktarlarını hesaplamak. Deoksiguanozin üzerinde 8-oxo-deoksiguanozin için molar fraksiyonları hesaplayın, 1, Deoksiadenozin üzerinde N6-etheno-deoksiadenosin, ve 1, Deoksiguanozin üzerinde N2-etheno-deoksiguanozin, hangi bir milyon normal deoksiguanozin veya deoksiadenosin başına lezyonların sayısını vermek. HPLC-UV ile elde edilen safdna'nın temsili bir kromatogramı, RNA ribonükleozitlerinden arındırılmış dört normal deoksinükleonitin varlığını gösterir ve DNA saflığını gösterir.
HPLC-ESI-MS/MS 8-oxo-deoksiguanozin, 1, N6-etheno-deoksiadenozin ve 1, N2-etheno-deoksiguanozinden temsilen kromatogramlar fare dokusu DNA örneklerinde gösterilmiştir. UV tespiti ile elde edilen kromatogram, ilk kolondan yaklaşık 10 dakikaya kadar eluting eden dört normal deoksinükleoziti, 8-oxo-deoksiguanozinden iyi bir ayrım ile istenmeyen girişimleri ortadan kaldırır. Tam nicelikler için hatırlanması gereken önemli bir şey, kalibrasyon eğrileri ve numunelerde enjeksiyon hacminde her zaman aynı miktarda iç standartlara sahip olmaktır.
Burada sunulan yöntemler diğer modifiye deoksinükleozitlerin nicelleştirilmesi için uyarlanabilir. Modifiye deoksinükleonit bandının genişletilmesi altta yatan patofizyolojik mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlar. Ksenobiyotiklere maruz kalma, diyabet ve hücre malign transformasyonu gibi farklı durumlarda oksidatif hasarın rolünü araştırarak önleyici ve tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabiliriz.
